Метод за титруване на анти-бяс вирус неутрализиращи антитела

Изобретението се отнася до областта на ветеринарната вирусология, по-специално до метод за титриране на неутрализиращи вируса антитела срещу бяс в кръвния серум на ваксинирани животни. Същността на метода е, че ваксината щам вирус на бяс 71 BelNIIEV-VGNKI взаимодейства с тестваните серуми, вирус-серумната реакционна смес се инкубира в продължение на 60 минути при 37 ° C, въвежда се ежедневна непокътната сайга култура на бъбречни клетки и се поставя в CO2 инкубатор с последващо определяне на 5-7 дни от титъра на вирус-неутрализиращи антитела при ограничаващо разреждане на серума, при което се наблюдава 50% потискане на цитопатичния ефект на вируса върху клетъчната култура. Техническият резултат е разработването на чувствителен, по-технологичен и икономически жизнеспособен метод за титруване на анти-бяс вирус-неутрализиращи антитела. 2 раздел.

Изобретението се отнася до областта на ветеринарната вирусология, а именно до метод за титруване на неутрализиращи антитела срещу бяс в кръвния серум на ваксинирани животни, базиран на инхибиране на цитопатичното действие (CPE) на вируса на бяс в клетъчната култура, и може да бъде използва се в изследователски институти и ветеринарни лаборатории.

Най-честият тест за определяне на анти-бяс вирус неутрализиращи антитела в кръвта на животните е реакцията на неутрализация при мишки, разработена през 1935 г. (Webster L., Dawson J. Диагностика на бяс чрез инокулация на мишки. Измерване на хуморален имунитет към бяс чрез тест за защита на мишка // Proc Soc Exp Biol Med 1935 Vol 32 P 570-573). Въпреки предимствата на този тест, доказан от времето и практиката, той има някои недостатъци: провеждането на проучването в рамките на 15-21 дни, относително скъпите разходи за животни и използването на жив вирус, което е свързано с опасност за изследовател.

В момента са разработени и приложени различни методи за in vitro титруване на антитела срещу бяс.

За проследяване на нивото на специфични антитела в кръвния серум на ваксинирани животни, по-специално се използва ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) (Nicholson KG, Prestage H. Ензимно-свързан имуносорбентен тест: Бърз възпроизводим тест за измерване на антитяло срещу бяс // J.Med. Virol. - 1982. - Vol.9, No. 1. - P.43-49; Smith JS, Karamany RM, Kazar J., Malik SA, Badriya M. Бърз количествен анализ на бяс антитела след ваксинация чрез ELISA // APMIS. - 1988. - Vol.96, No 3. - P.40-43.; Botvinkin AD Откриване на антитела срещу вируса на бяс с помощта на ELISA в кръвни проби, събрани на хартиени дискове // Лаборатория . - 1988. - No 3. - С.73-75; Сазанова Е.Я., Кузнецова С.В., Маслов Е.В., Боцко А.А. Ензимен имуноанализ за индикация на вируса на бяс и определяне нивото на антителата // Ветеринарна медицина 1991. - No 8. - С.62-64). Този тест може да се извърши в практическа среда и резултатите могат да бъдат получени в рамките на няколко часа. Въпреки това, в допълнение към неутрализиращите антитела, този метод също така открива различни антитела от други видове, докато няма връзка между резултатите и данните от реакцията на неутрализация при мишки.

За определяне на вирусно-неутрализиращи антитела срещу бяс се използва тест за инхибиране на флуоресцентни огнища, извършен върху непрекъснати култури от клетки BNK-21, сайгака (PS), използвайки вируса на бяс, щамове ERA, CVS, Vnukovo-32/107, TC -80 (Zaian E. et. Al. Микротест за количествено определяне на неутрализиращи антитела срещу вируса на бяс // J. Biol. Stand. - 1979. - No. 7. - P.213-220; Lyng J. Анализ на мощността на антителата Доклад за съвместно проучване // J. Biol. Stand. - 1989. - Vol.17, No. 3. - P.267-280; Sologub TV Разработване и усъвършенстване на инструменти и методи за диагностика на бяс // дисертация. Кандидат на биологични науки. - Покров, 1993; Zavadova J. et. Al. Титруване на антитела чрез бърз тест за инхибиране на флуоресцентен фокус (RFFIT) // Veter. Med. (Praha). - 1996. - Т. 41, № 7. - P.225-230; Недосеков В. В. и др. Титруване на антитела срещу бяс с помощта на тест за инхибиране на флуоресцентен фокус // Ветеринарна медицина. - 1998. - N. 7. - 28-30 и др.).

Принципът на настройване на реакцията в цитираните източници е почти идентичен и се състои в това, че разрежданията на серумите се смесват с еднакъв обем на вируса и се инкубират при 37 ° С в продължение на 90 минути, след което реакционната смес се добавя се към съответната клетъчна култура и се инкубира в продължение на 72 часа при 37 ° С. След това клетъчната култура се фиксира, третира се с антирабични имуноглобулини, конюгирани с флуоресцеин изотиоцианат (FITC-конюгат) и реакцията се записва чрез луминесцентна микроскопия.

Предложените методи включват фиксиране на клетки с формалин или ацетон, които са токсични лекарства, и използването на високоспецифични анти-бяс имуноглобулини, конюгирани с флуоресцеин изотиоцианат, което до известна степен усложнява технологията за изследване на животински кръвен серум и увеличава цената на анализа .

Прототипът на настоящото изобретение е предварително разработеният тест за инхибиране на флуоресцентни огнища, който включва взаимодействието на компонентите на реакционната смес (вирус на бяс, щам TS-80, със специфичен серум) в продължение на 90 минути, оценено чрез инхибиране на флуоресценцията огнища в PS клетъчна култура (Недосеков В. В. със сътрудници Титруване на антитела срещу бяс с помощта на тест за инхибиране на флуоресцентен фокус // Ветеринарен. - 1998. - № 7. - С.28-30. Пат. № 2130187 RU).

Целта на настоящото изобретение е да се разработи чувствителен, по-технологичен и икономически обоснован метод за титруване на антитела, неутрализиращи вируса на бяс, който корелира с резултатите от титруване на антитела в теста за инхибиране на флуоресцентния фокус.

Тази цел се постига чрез използване на ваксинния щам 71BELNIIEV-VGNKI (RB-71), адаптиран към PS клетъчната култура, в който реакционната смес вирус-серум се инкубира в продължение на 60 минути, последвано от определяне, на 5-7 дни, на титърът на вирусно неутрализиращи антитела за инхибиране на цитопатичния ефект на вируса в PS клетъчна култура.

В родната литература няма материали и резултати от подобни изследвания.

ПРИМЕРИ ЗА СПЕЦИФИЧНО ИЗПЪЛНЕНИЕ

Тестовите серуми, получени от ваксинирани животни, се инактивират при 56 ° С в продължение на 30 минути, след което се приготвят двукратни разреждания в 96-ямкови микрокултурни панели в среда на Eagle (MEM) в обем от 50 μl. Разредените серуми се смесват с еднакъв обем от култивирания вирус на бяс, бр. RB-71, съдържащ 50-100 KKID50 (работно разреждане). Така приготвените реакционни смеси се инкубират в продължение на 60 минути при 37 ° С, след което се въвеждат в еднодневна непокътната PS клетъчна култура, отглеждана в панели с 96 ямки, след отстраняване на хранителната среда от ямките.

Започвайки от ден 4, клетъчната култура в панелите се разглежда с помощта на обърнат светлинен микроскоп на Olympus, увеличение x40-80. В ямките с вирусен контрол и нормален серум се наблюдава изразена CPP, която се характеризира с подуване на засегнатите PS клетки, закръгляването им с появата на гранулираност в цитоплазмата, последвано от разрушаване и отделяне от стъклото, в същото време време, в ямките със специфичен серум, CPP не се появява (неутрализация на вируса), което показва наличието на анти-бяс вирус неутрализиращи антитела в тестваните серуми.

Резултатите от реакцията се записват на 5-7 дни. Титърът на антирабичните антитела в тествания материал е ограничителното разреждане на серума, при което се наблюдава 50% потискане на цитопатичния ефект на вируса върху клетъчната култура, т.е. неутрализация на вируса. При провеждане на проучвания резултатите от определянето на антитела и в двата примера бяха сходни.

Резултатите от изследването на кръвен серум чрез тест за инхибиране на огнищата на флуоресценция и предложената реакция на неутрализация в PS клетъчната култура са дадени по-долу (Таблица 1).