Прости методи за оцветяване на намазки

С простия метод на оцветяване, няколко капки малко алкохолно-воден или воден разтвор на боя се изсипват върху фиксирана намазка за 1-2 минути; най-често за тази цел се използва фуксин (1:10) или метиленово синьо на Лефлер. След това боята се измива с дестилирана вода и намазката се изсушава между две ленти филтърна хартия. Обикновено фуксин (1:10) боя за 10-30 секунди и метиленово синьо - 2-10 минути. Фуксиновите петна се размазват по-интензивно и при оцветяване с метиленово синьо се получават деликатни, по-елегантни препарати. След изсушаване с филтърна хартия, намазката трябва да е напълно суха, в противен случай, когато останалата влага влезе в контакт с кедровото масло, се образува емулсия и с микроскопия ще се получи неясно изображение. По принцип продължителността на оцветяването зависи от вида и качеството на оцветяващия разтвор, степента на податливост на микроба към оцветяването и дебелината на цитонамазката.

Оцветяване по Муромцев

Изготвят се две решения:

След разтваряне на боята и двата разтвора се смесват и филтрират през хартиен филтър. Боята издържа дълго време. Мазките се оцветяват през ленти от филтърна хартия за 15 - 30 секунди.

С това оцветяване на намазки, включвания, биполярност, капсули и спори се откриват в микробните клетки. Методът е удобен за оцветяване на намазки от органи, кръв, култури върху среди с естествен протеин и върху полутечен агар.

Фонът на препарата от посочените субстрати е розов; тъканните клетки и микробните тела са оцветени в синкаво-синьо.

Комплексни (диференциални) методи за оцветяване с намазка

Комплексните методи за оцветяване се основават на особеностите на физикохимичната структура на микробната клетка. Същността на тези методи се крие в ефекта върху размазването на две багрила, от които едната е основната (основната) боя, а другата е допълнителна (контрастна) боя. След излагане на първата боя намазката се обезцветява и едва след това се подлага на допълнително оцветяване. Редица химически реактиви (киселини, основи, алкохол, ацетон и др.) Могат да се използват като избелващи агенти. Измиването на намазката с обикновена вода също е чисто механичен процес на избелване, но това отнема много време; освен това обезцветяването е непълно. По отношение на обезцветяващите вещества микробите могат да бъдат разделени на групи с лесно и трудно обезцветяване. Не всички видове микроби са създадени равни на избелващи агенти; някои са устойчиви на киселина и алкохол, други са само устойчиви на киселина. И накрая, някои, като спорите, енергично се противопоставят на ефектите на всички обезцветяващи агенти и принадлежат към групата на устойчиви на боя.

Комплексните методи за оцветяване имат голямо диференциално диагностично значение за характеристиките на изследвания микроб.

Грам петно

При обработката на цитонамазки (разрези) от органи и тъкани, съдържащи микроорганизми, тинтява виолетово и след това йод, лекарството, боядисано в черно, има свойството да се обезцветява под въздействието на алкохол. В този случай някои от бактериите, съдържащи се в цитонамазката, също се обезцветяват, докато други­пришити в лилаво. С допълнително оцветяване (по-специално с фуксин на Pfeiffer), обезцветените с алкохол бактерии стават червени (грам-отрицателни). Други, здраво задържащи виолетовия цвят (съединение йод + тинтява виолетово), не избледняват­на алкохолна основа, принадлежат към групата на грам-положителните бактерии. Разликата между грам-положителните и грам-отрицателните бактерии зависи от разликата в техните изоелектрични точки, а способността на грам-положителните бактерии да запазят цвета си е свързана с наличието в тях на магнезиевата сол на рибонуклеиновата киселина, която грам-отрицателна бактериите не съдържат. Грамното оцветяване се получава най-добре след фиксиране на намазки чрез физически метод (нагряване). Особеностите на връзката на определени видове бактерии с различни цветове, по-специално с оцветяването по метода на Грам, характеризират така наречените тинкториални свойства на микробите.

Техника на рисуване. Върху фиксирана с топлина намазка поставете лента от филтърна хартия малко по-къса и по-тясна от предметното стъкло, изсипете върху нея достатъчно количество кристално виолетов разтвор, карболов или анилинов разтвор от тинтява виолетово или някаква друга виолетова трифенилметанова боя (например метил виолет) за 1-2 минути. След това боята се излива, лента филтърна хартия се отстранява и, без да се изплаква с вода, разтворът на Lugol се излива върху намазката за 1-2 минути. Разтворът се отцежда и препаратът се обезцветява в 96 ° алкохол за 30-60 секунди, измива се с вода и допълнително се оцветява с Pfeiffer фуксин (или разреден сафра­nin, neutralroth или vesuvine) за 2-3 минути. След това боята се измива с вода и намазката се изсушава с чиста филтърна хартия.

Микроскопска картина: с правилното оцветяване на Грама на цитонамазки, грам-положителните микроби ще бъдат оцветени в тъмно лилав цвят, а грам-отрицателните микроби в цвета на допълнителна боя (например в розовия цвят на Pfeiffer фуксин).

Не използвайте замърсена филтърна хартия: възможно е механично прехвърляне на микроби от една мазка в друга, което може да се отрази­разчитайте на резултатите от микроскопията. Продължителността на излагане на боя, разтвор на Лугол (морилка) и алкохол зависи от дебелината на цитонамазката. Особено важен момент при оцветяването по Грам е оцветяването на цитонамазката с алкохол. При кратко излагане на алкохол се получават пребоядисани препарати и при продължително излагане всички микроби (включително rpa-положителните) ще се обезцветят. При дебела, дебела намазка (напр. От агарова култура) времето за излагане на алкохол трябва да е по-дълго, отколкото при тънка намазка, особено от течни култури. При излагане на алкохол върху неравномерно приготвена намазка в дебелите му части остават микроби­не бяха обезцветени и обезцветени в тънки; получавате "пъстра" живописна картина, която може да доведе до грешни заключения.

Понякога в културата на грам-положителни бактерии могат да се наблюдават грам-отрицателни индивиди, които са колкото повече, толкова по-възрастна е популацията. Това не е нищо повече от бактериални трупове, претърпели вътреклетъчна автолиза, в резултат на което клетката е загубила магнезиевите рибонуклеинати. От друга страна, в много млади култури (няколко часа растеж) от семейството на Enterobacteriaceae, гигантски, млади форми на тези бактерии, които са 2-3 пъти по-големи от възрастните (18-часови), са много базофилни поради претоварване на тяхната цитоплазма с рибонуклеинати. Следователно, когато се оцветяват по Грам, те се оцветяват с фуксин толкова интензивно, че при лоша светлина те могат да бъдат объркани с грам-положителни вегетативни форми на спороносни пръчки.

За начинаещи, както и при съмнителни случаи, се препоръчва на същото стъкло, където е разположена пробата, да се подготви­лекарства за трол - едното от културата на микробите, очевидно грам-положително, а другото от грам-отрицателно.

Ако препаратът е обезцветен в Грам, може да се налее алкохол­поставете директно върху намазката, като непрекъснато разклащате чашата. По-добре е да се извърши обезцветяване в кювети, където се налива алкохол и като се взема препаратът с пинсета на Корне, да се повдига и спуска, следвайки цвета на стена­наливане на алкохол от чашата. Обезцветяването се счита за завършено, когато капки алкохол, изтичащи от намазката, станат по цвят на алкохола в кюветата; това обикновено отнема 10-30 секунди, в зависимост от дебелината на цитонамазката.

Алкохолът 96 ° в кюветите трябва да се сменя по-често (80 ° алкохол вече неправилно разграничава цитонамазката). Отпадъчният алкохол обикновено се източва от кюветите в алкохолни горелки.

За начинаещи препоръчваме обезцветяване на намазки с йодиран алкохол. Установено е, че ако към течността за обезцветяване се добави малко йодна тинктура, тогава оцветяващите грам-положителни микроби не се обезцветяват в такава течност дори в рамките на един час, а грам-отрицателните оцветяват за около 5 секунди. По дан­ним Саватеев, достатъчно е да добавите 2-4 ml 10% йодна тинктура на 100 ml 95 ° алкохол; разтворът може да се съхранява дълго време. В случай, че вместо алкохол се използва ацетон, преди употреба се добавя йодна тинктура.

За обезцветяване на намазки с йодиран алкохол са достатъчни две минути, последвани от изплакване с вода и допълнителни­Пурпурно оцветяване Pfeiffer.