Реакция на латексна аглутинация

Реакция на латексна аглутинация (RAL), или реакцията на латекс аглутинация, е разработена отдавна, но не е намерила широко приложение в медицината и ветеринарната медицина.

Независимо от това, нарастващата тенденция за използване на инертни синтетични материали като носители на антигени и антитела доведе до възраждане на интереса към RAL и широко проучване на възможностите за неговото приложение.

Метод принцип. Механизмът RAL е подобен на този на RIGA, който използва сенсибилизирани към антиген или антитела човешки или животински еритроцити. За определяне на RAL се използват сенсибилизирани частици от полистиролов латекс, които се слепват в присъствието на хомоложен реагент. Обикновено тази реакция протича много бързо (3 ... 8 минути), което прави възможно използването й като експресен метод за откриване на антигени и антитела.

Предимствата на RAL са, че латексовите частици, за разлика от еритроцитите, нямат кръстосано реагиращи антигени, поради което е по-специфичен от RIGA.

Материали и реактиви. един. Латекс суспензия. За приготвянето на диагностикуми обикновено се използват латексови частици с диаметър 0,81 ... 1 μm. Когато се използват по-големи частици с диаметър 0,22 ... 0,3 микрона, е трудно да се вземе предвид реакцията и технологичният процес за получаване на диагностициуми е рязко сложен, а частиците по-големи от 1 μm, въпреки че това не влияе върху активността на латексни диагностициуми, но значително увеличава честотата на неспецифични реакции.

За определяне на RAL е по-добре да се използват пречистени латекси с хомогенни частици с правилна сферична форма. Плътността на латексната суспензия обикновено е 1%, но в някои случаи може да достигне 1,3 ... 1,4%.

2. Буферни решения. За приготвяне на суспензия от чувствителни латексови частици може да се използва изотоничен разтвор на натриев хлорид, но е по-целесъобразно да се използват буферни разтвори: трис (рН 7,2 ... 8,2), трис солна киселина (рН 7,2), глицин (рН 8.2), гликолова, борат-сол и др. В този случай е желателно да се извършат предварителни тестове на системата "латекс - буфер" при експериментални условия и да се избере оптималната опция за практическа работа. Понякога в процеса на подготовка на латексния диагностик се налага да се използват няколко различни буферни разтвори.

3. Антитела. За сенсибилизиране на латексни частици са подходящи хиперимунни серуми, получени чрез имунизиране на лабораторни животни (зайци, плъхове, мишки и др.). Използването на пречистени имуноглобулинови фракции допринася за увеличаване на специфичността на RAL и намаляване на броя на фалшиво положителните и кръстосаните реакции.

Методология на изследването. Основните етапи на определяне на RAL. Понастоящем RAL обикновено се извършва върху стъклени или полистиренови плочи с търговска диагностика или лекарства. По-рядко плочи с кладенци се използват за настройка на RIGA или версия на епруветка на реакцията. Манипулациите се извършват в определена последователност.

1. Направете серия от серийни разреждания на тествания материал. Кръвният серум трябва да бъде предварително загрят за 30 минути при 56 ° C или 20 минути при 60 ° C. При задаване на RAL върху плочи за RIGA, микротитърните контури се използват при разреждане на материала. Върху плоски, равномерни плочи се нанася една капка от съответните разреждания.

2. Добавете равен обем от чувствителната латексна суспензия към всяко разреждане. Смесете 1 капка от тестовия материал и диагностикум, добавете 15, 25 или 50 μl реакционни съставки в ямките.

Когато се поставя RAL в епруветка, се използват 0,25 ml от тестовия материал и 0,05 ml (или 0,1 ml) от диагностикума.

3. Плаките се поставят на въртяща се маса или в стрелец за 3 ... 5 минути, след което се записват резултатите от реакцията.

Отчитане на резултатите. Независимо от вида на диагностикума и количеството антитела (антиген) в тествания материал, резултатите от RAL могат да бъдат взети предвид в рамките на няколко минути след смесването на реагентите. В присъствието на желания микроорганизъм в изследваната проба залепващите латексови частици образуват аглутинат, който е ясно видим с просто око. Могат да се използват лупи с ниско увеличение. При отрицателни резултати от реакцията латексовата суспензия остава хомогенно мътна, без бучки аглутинат и зони на избистряне. С ниска или ниска активност на диагностикума, както и ниска концентрация на антиген, е по-добре да се инкубират плочите при 37 ° C, което до известна степен ускорява образуването на аглутинат.

Резултатът от реакцията се оценява с помощта на триточкова система:

„++++“ - бистра аглутинация, големи люспи в бистра течност;

"++" - ясна видима аглутинация на диагностикума, обаче фонът не е напълно изяснен;

"-" - течността остава хомогенна-мътна (отрицателна реакция).

Неуместно е да се използват междинни оценки на интензивността на реакцията ("+++", "+"), тъй като те са доста субективни.

Задават се няколко контроли: 1) първоначално разреждане на тествания материал + суспензия на несенсибилизиран латекс (отрицателна контрола); 2) нормален серум, който не съдържа антитела + суспензия на сенсибилизиран латекс (проверка на специфичността на диагностикума); 3) хомоложен имунен серум + суспензия от сенсибилизиран латекс (тест за диагностична активност).

При определяне на RAL с диагностични латексни антитела, съответният антигенсъдържащ материал се използва за контрол на положителни и отрицателни реакции.

Техника на подготовка на диагностикумите. Сенсибилизация на латекс с антигени. За приготвянето на антигенен диагностичен латекс е желателно да има на разположение разтворими антигени. В този случай се получават добри резултати при използване на буферни разтвори (например глицин или борат с рН 8,2). В този буфер се приготвя разтвор на антиген в концентрация 2,5 ... 5,0 mg/ml до 1 обем латексна суспензия. Ако антигенният разтвор се приготвя в изотоничен разтвор на натриев хлорид, тогава буферът се добавя към сместа латекс - антиген.

Сенсибилизацията се извършва в продължение на 2 часа при 37 ° C в термостат или (по-добре) във водна баня. След това време сенсибилизираният латекс се утаява чрез центрофугиране за 5 ... 10 минути при скорост 2000 ... 2500 min -1 и се суспендира отново в същия буферен разтвор за получаване на 1% суспензия.

Сенсибилизация на антитела към латекс. Латексната суспензия се смесва с еднакъв обем имунен серум или пречистена фракция на гама глобулин в подходящ буферен разтвор. Сместа се инкубира в продължение на 30 минути при стайна температура или при 37 ° С, центрофугира се в продължение на 30 минути при скорост 3 ... 5000 мин -1 и утайката се промива два пъти с 0,01 М трис-солна киселина буфер с добавяне на 200 mg/l поливинилпиролидон. Сенсибилизираният латекс се ресуспендира в същия буферен разтвор с поливинилпиролидон и 0,05% натриев азид и се съхранява в хладилник при 2 ... 4 ° C.

При избора на оптималната доза антитела за сенсибилизиращ латекс трябва да се има предвид, че една от частиците му с диаметър 0,8 μm може да адсорбира до 7,5 ∙ 10 4 молекули гама глобулин на повърхността си.

Трябва да се отбележи, че в много отношения е необходимо предварително емпирично да се изберат оптималните условия за получаване на висококачествена латексна диагностика. Режимът на сенсибилизация зависи от вида и размера на латексните частици, рН и вида на буферните разтвори и редица други фактори.

За да се намали честотата на фалшиво положителните резултати, се препоръчва да се добави нормален серум от вида животно, който е бил използван за приготвяне на хиперимунен серум към готовата суспензия от сенсибилизирани латексни частици.

Получаване на латексна диагностика с използване на протеин А на стафилококи. Приложение за производство на диагностични комплекти на базата на латексни частици, покрити със стафилококов протеин А, позволява използването на всеки имунен серум за сенсибилизация на латекс без предварително третиране.

Протеин Разтвор (1 mg/ml) се приготвя в дестилирана вода с добавка на 0,05% натриев азид. Преди употреба се разрежда 200 пъти с 0,1 М глицинов буфер (рН 8,2), съдържащ 1% натриев хлорид. Стандартна търговска латексна суспензия се разрежда 15 пъти с изотоничен разтвор на натриев хлорид, смесва се с равен обем разреден разтвор на протеин А, инкубира се при постоянно разбъркване в продължение на 2 ... 4 часа при 20 ° С и след това 16 ... 18 часа при 4 ° C. Латексните частици, покрити с протеин А, се утаяват чрез центрофугиране със скорост 6000 min -1 за 30 минути и се промиват два пъти с половин обем глицинов буфер с добавяне на 0,02% поливинилпиролидон. Получената суспензия след добавяне на 0,05% натриев азид може да се съхранява при 4 ° C в продължение на 4 месеца.

Имунният серум се разрежда до титър с глицинов буфер и се смесва с равен обем латексна суспензия, покрита с протеин А. Инкубацията и измиването на чувствителния към антитела латекс се извършва, както е описано по-горе.

Същата техника може да се използва за сенсибилизиране на латекс с гама-глобулинови фракции, изолирани от имунни серуми чрез насищане с амониев сулфат. В този случай продължителността на сенсибилизацията на антитела на латексни частици, покрити с протеин А, може да бъде намалена до 2 часа, с изключение на дългия 2-ри етап, проведен при 4 ° С. Диагностичният препарат, приготвен по този начин, е 4 ... 16 пъти по-активен от обичайния антигелен латекс диагностик.

Практическа употреба. За съжаление, в практическите ветеринарни лаборатории RAL практически не се използва, въпреки че превъзхожда много класически серологични методи по чувствителност и специфичност.

В момента има съобщения за успешното използване на RAL за диагностика на туларемия, бруцелоза и редица вирусни инфекции. Когато се използват тези диагностични комплекти, чувствителността на RAL върху стъкло е 10 6 mt/ml, а при поставяне в полистиренови плочи - 1,8 ∙ 10 4 mt/ml (бруцелоза) и 1,25 ∙ 10 5 mt./Ml (туларемия). Освен това е разработена латексна диагностика за откриване на причинителите на йерсиниоза, псевдотуберкулоза, листериоза и салмонелоза. Има и информация за успешни тестове на латексен антигенен диагностичен комплект, специално разработен за ветеринарна медицина за откриване на антитела към причинителя на туберкулозата.

Безусловните предимства на RAL: 1) лекота на настройка; 2) отсъствието на специално оборудване; 3) достатъчно висока чувствителност и специфичност.