Реакция на латексна аглутинация

Историческа справка

Методът за реакция на латексна аглутинация (LAT) е предложен за първи път през 1956 г. и се използва за определяне на ревматоиден фактор, като се използват полистиролови латексни микросфери с тясно разпределение на частиците по размер, покрити с човешки гама глобулин. Съобщава се, че взаимодействието на антигени в кръвния серум на пациента с гама глобулин, адсорбиран на повърхността на хидрофобните микросфери на суспензията, води до аглутинация на полимерни частици и образуване на големи агломерати, които лесно се различават с невъоръжено око. През следващите години методът RLA стана широко разпространен, както в клинично диагностични тестове, така и в биохимични и имунологични изследвания. Особено широко приложение на RLA се наблюдава при инфекциозна патология.

Описание на метода на реакция на латексна аглутинация

Реакцията на латекс аглутинация се използва в клиничната химия в продължение на много години като прост, бърз и евтин метод за определяне на протеини, хормони и други биологично активни съединения. Протеините, които са поливалентни антигени, реагират с антитела, образувайки имунни комплекси или аглутинати. По правило имунните комплекси се визуализират зле не само с невъоръжено око, но и с помощта на фотометрични методи. Използването на дисперсионни полимери (латекси), сенсибилизирани с антитела или антигени, дава възможност значително да се улесни откриването на реакцията на аглутинация, която в този случай се нарича реакция на латекс аглутинация.

Носители за метода на реакция на латексна аглутинация

Най-често за получаване на диагностични препарати се използват полистиренови микросфери, които носят на своята повърхност различни функционални групи (карбоксил, епокси, алдехид и др.) И полиакролеинови микросфери, съдържащи алдехидни функционални групи на повърхността си, които могат да реагират с първични амино групи, образувайки a Schiff base Използването на инертни синтетични носители за имобилизиране на антитела (или антигени) е широко разпространен методологичен подход в имуноанализата.

Полимерните микросфери с тясно разпределение на частиците и функционални групи на повърхността представляват голям интерес за биологията и медицината, по-специално за използването като носители на биолиганди вместо еритроцити при създаване на диагностични системи за тестове за различни видове заболявания. Замяната на еритроцитите с полимерни микросфери е решение на проблемите, свързани с недостатъците на диагностиката на еритроцитите, а именно:

За да заменят еритроцитите, полимерните микросфери трябва да имат определени свойства: скорост на утаяване 3 - 8 mm/h, диаметър на частиците около 5 микрона. за ковалентно свързване с функционални групи протеини.

Едно от предимствата на използването на полимерни микросфери като носители на биолиганди е възможността за получаване на полимерни частици с даден набор от свойства. За да се премахнат проблемите, свързани с използването на еритроцити, се използват полимерни микросфери с определени свойства:

  • 1) монодисперсно разпределение на размера
  • 2) сферична форма
  • 3) устойчивост на електролити в широк диапазон на рН
  • 4) способността да се прикрепят биологични макромолекули без значителни промени в тяхната функционална активност
  • 5) възпроизводими свойства и характеристики

Еднородността на частиците по размер позволява доста точно да се определи повърхността на носителя и да се установи степента на покритието му с биолиганда, освен това определя сходния характер на тяхното поведение по време на аглутинацията, което улеснява „Отчитане“ на резултатите от реакцията на латекс аглутинация (RLA). За първи път полистиреновите микросфери бяха използвани за създаване на диагностични тестови системи. Полистиролът, поради своята оптична прозрачност, висока адсорбционна способност, здравина и добра възпроизводимост на свойствата, успешно се използва като носител.

Основният проблем на полимерните микросфери, използвани за създаване на диагностични комплекти, е неспецифичната аглутинация (частици с отрицателен контрол образуват ореол от частици около центъра на дъното на кладенеца), причините за това и причините за това все още са до голяма степен неясни. Значително разреждане на проби, добавяне на детергенти и скрининг на повърхността на частиците с протеини с ниско молекулно тегло са най-широко използвани като методи за намаляване на неспецифичното свързване. Използването на тези методи обаче най-често води до намаляване на чувствителността и точността на реакцията на латекс аглутинация.

С внимателно разработване на метода за получаване на латексни диагностици, спазване на оптималните условия за тяхното приготвяне и задаване на самата реакция, RLA може да се доближи до най-съвременните имунологични методи.

RLA е подобен на RNGA по принципа на адсорбция на антитела на повърхността на по-големи частици.

Предимствата на метода RLA

RLA реакцията е експресен метод за диагностика на инфекциозни заболявания (продължителността е до 10 минути, възможно е да се открие антиген в малък обем от тестовия материал). За настройка на RLA се използват стъклени или тъмнополеви плочи.

RLA като сигнален експресен тест за откриване на антигени на микроорганизми е удобен, когато се използва в практически лаборатории, както и при провеждане на масови изследвания. Предимствата на RLA като метод за серологична диагностика на бактериални и вирусни инфекции включват следните точки:

  • - висока специфичност и чувствителност;
  • - няма нужда от сложно оборудване за настройка и реакция и регистриране на резултатите;
  • - минимизиране броя на реакционните компоненти;
  • - възможността за получаване на инертни носители с определени характеристики.

Относителната евтиност на метода на реакцията на латексна аглутинация (RLA), простотата и възможността за поставяне на теста при почти всякакви условия го правят много удобен както за единични, така и за масови изследвания, дори в малки клинични лаборатории с малко оборудване.

Прилагане на метода за реакция на латексна аглутинация

RLA се използва за обозначаване на антигени на Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae тип b (Neisseria meningitidis при CSF, откриване на стрептококи от група А в тампони от гърлото, при диагностициране на салмонелна инфекция, йерсиниоза и други заболявания. Чувствителността на метода е 1-10 ng/ml (103-106 Недостатъкът на този метод е възможността за получаване на артефакти, особено при наличие на ревматоидни фактори и продукти на фибринолиза на плексуса с участието на комплемент - утайки. Най-простият пример за качествена реакция на утаяване е образуването на непрозрачна лента за утаяване в епруветка на границата на наслояване на антиген върху имунния серум (реакция на утаяване на пръстена Реакцията на утаяване се провежда в агар и агарозни гелове, които се използват за идентифициране и изследване на свойствата на различни антигени и антитела.

Материали и реактиви за метода на реакция на латексна аглутинация

  • 1. Латекс суспензия. За приготвянето на диагностикуми обикновено се използват латексови частици с диаметър 0,81 ... 1 μm. Когато се използват по-големи частици с диаметър 0,22 ... 0,3 µm, е трудно да се вземе предвид реакцията и технологичният процес за получаване на диагностициуми се усложнява рязко, а частиците по-големи от 1 µm, въпреки че това не влияе върху активността на латексни диагностициуми, значително увеличава честотата на неспецифични реакции. За определяне на RAL е по-добре да се използват пречистени латекси с хомогенни частици с правилна сферична форма. Плътността на латексната суспензия обикновено е 1%, но в някои случаи може да достигне 1,3 ... 1,4%.
  • 2. Буферни разтвори. За приготвяне на суспензия от чувствителни латексови частици може да се използва изотоничен разтвор на натриев хлорид, но е по-целесъобразно да се използват буферни разтвори: трис (рН 7,2 ... 8,2), трис солна киселина (рН 7,2), глицин (рН 8.2), гликолова, борат-сол и др. В този случай е желателно да се извършат предварителни тестове на системата "латекс - буфер" при експериментални условия и да се избере оптималната опция за практическа работа. Понякога в процеса на подготовка на латексния диагностик се налага да се използват няколко различни буферни разтвори.
  • 3. Антитела. За сенсибилизиране на латексни частици са подходящи хиперимунни серуми, получени чрез имунизиране на лабораторни животни (зайци, плъхове, мишки и др.). Използването на пречистени имуноглобулинови фракции допринася за увеличаване на специфичността на RAL и намаляване на броя на фалшиво положителните и кръстосаните реакции.