Циклични нуклеотиди

Цикличните нуклеотиди са нуклеотиди, които образуват химическа връзка между два въглеродни атома на рибозата. Цикличните нуклеотиди с връзка между C3 'и C5' въглеродните атоми на рибозата са от биологично значение. Най-изследвани са производни на аденозин и гуанозин - цикличен AMP (cAMP) и цикличен GMP (cGMP).

Основните функции на цикличните нуклеотиди са предаването и усилването на молекулярния сигнал под действието на различни биологично активни съединения (хормони, цитокини и др.); cAMP, като вторичен пратеник, регулира различни клетъчни функции чрез активиране или инхибиране на специфични клетъчни протеини. Чрез промяна на активността на протеините. cAMP регулира експресията на специфични гени. cGMP участва в преобразуването на визуалните сигнали при животните.

Лекция 11 структура, свойства, биологична роля на нуклеиновите киселини

Нуклеиновите киселини са биологични полимери. Мономерни единици на ДНК и РНК са нуклеотиди - фосфорни естери на нуклеозидите. В природата има два вида нуклеинови киселини: ДНК (дезоксирибонуклеинова киселина) и РНК (рибонуклеинова киселина).

Мономерните остатъци в нуклеиновите киселини са свързани чрез фосфодиестерни връзки. И в ДНК, и в РНК тази връзка се осъществява само благодарение на 3′-OH групата на един нуклеотиден остатък и 5′-OH групата на другата (фиг. 11.1). Тази междунуклеотидна връзка се нарича 3 ', 5'-фосфодиестер.

ДНК и РНК веригите имат определена полярност или посока, тъй като всички междунуклеотидни фосфодиестерни връзки са ориентирани по веригата по същия начин. Поради полярността, всяка полинуклеотидна верига има 5 'край и 3' край. Поради наличието на 2'-OH група в рибозата, междунуклеотидните връзки в РНК са много по-лабилни, отколкото в ДНК; те лесно се хидролизират в присъствието на алкали.

Фигура: 11.1. Фосфодиестерна връзка в ДНК молекула

В момента са разработени и успешно прилагани методи за определяне на нуклеотидната последователност на ДНК и РНК. Оригиналната ДНК молекула е предварително фрагментирана с помощта на рестрикционни ензими. В този случай се извършва независимо разцепване на ДНК от два или повече рестрикционни ензима, в резултат на което се образуват припокриващи се фрагменти. Това позволява след определяне на нуклеотидната последователност на съответните фрагменти да се възстанови първичната структура на цялата ДНК.

Има два принципно различни подхода за определяне на първичната структура на ДНК. Първият се основава на химични реакции, при които се използват директно фрагменти от пречистена ДНК; във втория случай се използват ДНК копия на пречистени сегменти, получени чрез ензим. И двата метода са напълно автоматизирани. При секвениране на ДНК по метода на F. Sanger се въвеждат флуоресцентни етикети и се използват флуоресцентни агенти с различни спектрални характеристики за всеки от четирите анализирани нуклеотида, което позволява сканиране на гелове с различни дължини на вълната и предаване на информация директно на компютър.

Методът на A. Maxam и W. Gilbert използва химично секвениране, основано на химическа модификация на пуринови и пиримидинови основи с последващо разцепване на модифицирани нуклеотиди от полимерната верига и анализ на получените продукти чрез гел електрофореза. Радиоактивен етикет се въвежда в 5'-края на анализираната ДНК област, като се използва ензимът полинуклеотид киназа от фаг g-32P (ARF). Веднага след етикетирането едноверижните фрагменти се секвенират и двуверижните фрагменти се разделят на отделни вериги чрез денатурация. След това анализираната проба се разделя на четири порции, всяка от които се обработва специално, което води до разцепване на определен тип нуклеотиди. В този случай се използва диметил сулфат, който метилира пуринови основи (аденин в N3 позиция и гуанин в N7 позиция), както и хидразин, който разцепва и модифицира пиримидиновите основи. Освен това, като се използва обработка с пиперидин и хидролиза при различни стойности на рН, се извършва разцепването на някои модифицирани основи, придружено от разкъсване на съседни фосфодиестерни връзки. По този начин за всяка от четирите анализирани проби се получава набор от малки по размер ДНК фрагменти, някои от които носят радиоактивен етикет. Всички тези фрагменти са разделени чрез електрофореза, което ви позволява да разделите фрагменти, които се различават по дължина, с един нуклеотид. Получените електрофоретограми се разработват с помощта на рентгенов филм. В резултат се откриват само радиоактивни фрагменти, чрез които се определя нуклеотидната последователност на анализираната ДНК.

И така, първичната структура на нуклеиновите киселини е редът на редуване на нуклеотидни остатъци в полинуклеотидната верига.

Дифракционните модели на рентгеновите лъчи на ДНК влакна показват, че ДНК молекулата има спираловидна структура и съдържа повече от една полинуклеотидна верига. Киселинно-алкалното титруване показва, че структурата му е стабилизирана от водородни връзки.

Въз основа на тези данни J. Watson и F. Crick предлагат триизмерен модел на ДНК (фиг. 11.2). Според техния модел ДНК е правилна спирала с дясна ръка, образувана от две полинуклеотидни вериги, усукани една спрямо друга и около въображаема ос. Полинуклеотидните вериги са антипаралелни, т.е. ако единият от тях е ориентиран в посока 3 ′ - 5 ′, то другият - в посока 5 ′ - 3 ′. Следователно, на всеки от краищата на ДНК молекулата има 5'-края на едната верига и 3'-края на другата верига.

Всички азотни основи на веригите са разположени вътре в двойната спирала, а пентозофосфатният скелет е отвън. Полинуклеотидните вериги се държат една спрямо друга чрез водородни връзки, които се образуват между аденина на едната верига и тимина на другата. В този случай се образуват две водородни връзки: едната е между амино и кето групи, другата е между два азотни атома пурин и пиримидин, съответно. Между гуанин и цитозин се образуват три водородни връзки: две от тях са между амино и кето групите на съответните основи, третата е между азотните атоми на пурин и пиримидин. В тази връзка последователността в едната верига определя тяхната последователност в другата. Това е принципът на комплементарност - ключово свойство на ДНК. С тази комбинация от основи в полинуклеотидните вериги, всяка двойка съдържа три пръстена, следователно общият размер на тези двойки основи е еднакъв по цялата дължина на молекулата.

Диаметърът на спиралата е постоянен по цялата дължина и е равен на 2,0 nm. Пуриновите и пиримидиновите основи на двете вериги са подредени чрез взаимодействия в „купчини“ с интервал от 0,34 nm; равнините на пръстените са леко изместени една от друга. Пълният оборот на спиралата (дължината на спиралния завой), който съответства на нейния период на идентичност, е 3,40 nm. Има 10 нуклеотидни остатъка в една верига на един завой на спиралата. В оформената структура се разграничават две канали: - голяма, широка 2,2 nm; малка ширина 1,2 nm. Азотните основи в главните и второстепенните канали взаимодействат със специфични протеини, участващи в организацията на хроматина.

Фигура: 11.2. Двойна спирала на ДНК (от J. Watson и F. Crick)

ДНК молекулите могат да бъдат в различни конформационни състояния в зависимост от степента на поливане на биомолекулата, йонната сила на околната среда, видовете катиони и температурата.

Десните спирали образуват две семейства: A-семейство и B-семейство. А-семейството на ДНК е представено от така наречената А-форма на ДНК, изследвана от Р. Франклин и изолирана при ниска влажност. Тази полиморфна форма на ДНК има С3 'ендоконформация на захар, което води до намаляване на разстоянието между фосфатните групи и следователно до намаляване на разстоянието между двойките нуклеотиди по оста на спиралата. Това от своя страна води до увеличаване на броя на нуклеотидите на ход на спиралата (11 нуклеотидни остатъка на ход вместо десет). Двойките основи в А-формата образуват ъгъл от около 20˚ с оста на спиралата и са много отдалечени от оста на спиралата до периферията на молекулата: изместването достига 0,4-0,5 nm, т.е. почти половината от радиуса. В резултат на това А-формата на ДНК, когато се гледа отгоре, по оста на спиралата, изглежда като тръба. В А-формата на ДНК основите, принадлежащи към различни вериги, участват в подреждането, т.е. се извършва едно- и двуверижно подреждане. Това се дължи на стойността на ъгъла на наклона на равнините на основите към оста на спиралата и ъгъла на въртене на основите около оста на спиралата. В момента присъствието на А-формата на ДНК е доказано при някои бактерии, които се превръщат в спори при неблагоприятни условия и са в състояние да останат в това състояние, докато не се появят условия за размножаване. Тяхната ДНК е заобиколена от спорови протеини и е в А-форма, което я прави по-устойчива (около 10 пъти) на ултравиолетово лъчение, отколкото ДНК в други форми. Тези изследвания потвърдиха биологичното значение на A-формата на ДНК (Фигура 11.3).

Фигура: 11.3. Форми на ДНК: и - A-DNA, b - B-DNA, c - Z-DNA

В-формите на ДНК се характеризират със структурно разнообразие. ДНК формите със случайни последователности могат да бъдат в B-, C-, D- и други конформационни състояния при различни концентрации и температури на йони. Между тези различни форми се извършват взаимни преходи, което се дължи на разликите в степента на поливане на биомолекулата и йонната сила на околната среда.

Смята се, че различните форми на ДНК съответстват на различни функционални състояния. По този начин A-формата е характерна за процесите на транскрипция; при репликативни процеси ДНК е във В-форма; С-формата е най-подходяща за "опаковане" на ДНК в супрамолекулни структури и образуване на различни състояния на хроматин, включително за съхраняване на информация.

Z-образната ДНК има лява спирала и се намира в полинуклеотид с променлива последователност (dG-dC). Особеността на Z-формата е редуването на конформациите на нуклеотидни остатъци - син- и антиконформации на нуклеотиди. Основното подреждане има нови свойства, които са характерни само за тази спирала. Това се случва между цитозиновите остатъци от противоположните вериги, а гуаниновите остатъци изобщо не си взаимодействат, а влизат в контакт със съседни атоми на дезоксицитидин. Фосфатите в Z-формата не са еквивалентни един на друг. Фосфатният радиус на спиралата (разстоянието на фосфата до оста на спиралата) е 0,62 nm за d (CpG) и 0,76 nm за d (GpC). Съседните захари са ориентирани в противоположни посоки, поради което линията, свързваща фосфорните атоми във веригата, последователно придобива зигзагообразен вид. Възможни са преходи на ДНК от В-форма в Z-форма.

Преходният регион се движи по спиралата под формата на малка бримка. Преходът на В-формата на ДНК в Z-формата в малък регион на ДНК молекулата има много силен ефект върху топологията на суперспиралната ДНК и се използва от клетката в процеса на генна експресия.

С помощта на антитела беше възможно да се открие Z-формата на ДНК в междудисковите области на политеновите хромозоми. Вероятно Z-формата на ДНК играе някаква регулаторна роля във функционалните състояния на ДНК, тъй като са възможни и обратни преходи от Z-форма към B-форма. Всяка форма на ДНК има жлебове с определен размер. Z-образната форма има само един малък жлеб, през който преминава спиралната ос; тя е дълбока и тясна, ограничена от двете страни от фосфатни групи. Вътре в двойната спирала - конформационна микрохетерогенност.

Всяка форма на ДНК има малки и големи канали с определени размери. Специфичната способност на ДНК формите за комплексиране е свързана с различните размери на жлебовете. В по-голяма степен от другите части на ДНК молекулата, каналите са достъпни за водните молекули и металните йони. Стабилизиращият ефект на водните молекули е насочен към засилване на взаимодействията при подреждане; в случай на отслабване на последните, водните молекули конкурентно взаимодействат с протон-донорните и протон-акцепторните центрове на основите, дестабилизирайки двойната спирала. ДНК хидратацията играе важна роля при превръщането на формата А във формата В и обратно. Катионите се свързват главно с пентозофосфатния скелет, разположен главно в малкия жлеб на двойната спирала. Всичко това подчертава динамичността на структурата на ДНК и възможността за конформационни преходи в нея под въздействието на агенти от околната среда.

Биспиралните структури в молекула на ДНК също могат да се появят в рамките на една полидезоксирибонуклеотидна верига. За целта ДНК последователността трябва да съдържа обърнати или палиндромни повтарящи се последователности с дължина от няколко до много хиляди базови двойки. Поради наличието на собствена симетрия от втори ред, палиндромите могат да създадат "фиби" структури с кръстовидна форма, които осигуряват специфични взаимодействия между нуклеинови киселини и протеини и, вероятно, участват в регулаторни процеси.

Някои характеристики на различни форми на ДНК са дадени в табл. 11.1.