бактериален щам bacillus subtilis, използван за получаване на пробиотичен препарат, предназначен за профилактика и лечение на стомашно-чревни заболявания при животни, птици и риби

Изобретението се отнася до биотехнологиите, ветеринарната медицина и може да се използва за получаване на лекарство от групата на пробиотиците. Бактериалният щам Bacillus subtilis VKM B-2250D е изолиран от почвата. Клетките са грам-положителни, не образуват капсули, образуват кръгли спори, видът на дишането е аеробен. Хидролизира глюкозата, манитола. Не ферментира захароза, инозитол, сорбитол, малтоза, лактоза. Не образува газ по време на ферментация. Потиска растежа на стафилококи, Е. coli, ентеробактерии, цитробактерии, аеромони. Щамът се използва като производствен щам за получаване на пробиотичния препарат "Subtilis". Лекарството нормализира дейността на стомашно-чревния тракт на животни, птици, риби; обещаващ при лечението и профилактиката на бактериални инфекции. 1 раздел.

Чертежи към RF патента 2184774

Изобретението се отнася до биотехнологиите и може да се използва в микробиологичната индустрия за получаване на пробиотично лекарство, използвано във ветеринарната медицина за лечение и профилактика на стомашно-чревни заболявания на животни, птици и риби.

Известен щам Bacillus subtilis 534 - производител на пробиотика "Sporo-bacterin", който е предназначен за профилактика и лечение на стомашно-чревния тракт, дисбактериоза. SU 1708350, кл. A 61 K 35/66.

Недостатъците са кратък срок на годност, тъй като съдържа живи бактерии, които не могат да поддържат свойствата си дълго време, ниска чистота на препарата, който има тясно поле на приложение - като фуражна добавка за животни. Щамът също е чувствителен към антибиотици, с изключение на полимиксин, който ограничава обхвата на лекарството.

Известен щам Bacillus subtilis TPAXC-KM-117, който проявява инхибиторна активност срещу патогенни микроорганизми и има многократна лекарствена резистентност. Щамът е устойчив на тетрациклин, рифампицин, аленицилин, хлорамфеникол, апректомицин. На негова основа се изготвя устойчив на антибиотици пробиотик за лечение и профилактика на инфекциозни заболявания по време на антибиотична терапия със същото име (RU 2118364 C1, клас C 12 N 1/20, 27.08.1988 г.).

Задачата, която трябва да бъде решена от изобретението, е да се идентифицира нов ефективен щам на пробиотичния препарат "Subtilis" за ветеринарни цели и риболов.

Техническият резултат, постигнат чрез изпълнението на изобретението, се състои в повишаване на ефективността на лечението, увеличаване на смилаемостта на фуражите, производителност и наддаване на тегло на животни, домашни птици, риби поради използването на "Subtilis", стабилността на лекарството по време на съхранение в широк диапазон от околната температура.

Щамът Bacillus subtilis B-1601D е депозиран във Всеруската колекция от микроорганизми (IBFM, наречена на К. Г. Скрябин) под VKM B-2250D.

Щам Bacillus subtilis VKM B-2250D, изолиран от почвата.

Условия за съхранение: щамът може да се съхранява в лиофилизирано състояние в продължение на няколко години или върху уреди с агарова среда на основата на бульон от мезопатамия със задължително презасяване поне веднъж на 2 месеца върху същата среда.

Културни и морфологични характеристики. Пръчки. Размерът на клетките на еднодневна агарова култура е 3-5 μm. Клетките оцветяват положително за грам, образуват кръгли спори, единични, централни диаметри по-малки от диаметъра на клетката. Колониите на MPA са бели, пигментът не се отделя в средата.

Физиологични признаци. Аеробна, оптимална температура за растеж 37 o C и рН 4,0-8,0. Възможен е растеж в температурния диапазон 4-60 o С. Връзка с NaCl - растеж при 2-5%.

Биохимични признаци. Разгражда глюкозата, манитола. Неферментиращи въглеродни съединения: захароза, инозитол, сорбитол, малтоза, лактоза. Използва цитрат и ацетат. Не образува газ по време на ферментация. Произвежда оксидаза, каталаза.

Антагонистични знаци. Потиска растежа на стафилококи, Proteus, Klebsiella, Escherichia coli, Enterobacteriaceae, нитробактерии, Aeromonas, дрожди.

Щамът не е патогенен за растения, животни, риби и хора.

Тези таблици показват антагонистичната активност на тестовите щамове на микроорганизми (метод със забавен антагонизъм).

За култивиране на щама Bacillus subtilis BKM B-2250D използвайте течна хранителна среда на базата на 3% FGMS, рН 6,8-7,0, съдържаща 0,2% глюкоза (сухо вещество), 0,005% аминопептидаза или 0,02% кръвен серум.

Предварително сухата биомаса от микроорганизми се инокулира в епруветка с бульон. Когато се появи видим растеж, колониите се субкултивират върху мезопатамиев агар в епруветки.

Избират се типични колонии, които се субкултивират върху течна среда във флакони. След 24 часа цялата отгледана маса се прехвърля в 15-литрова бутилка с 9 литра хранителна среда и се култивира в продължение на 22 часа при 37-40 o С, като се получава инокулум.

Културална среда на базата на FGMS се поставя в реактор, стерилизира се при 1 атм в продължение на 60 минути, охлажда се до 39 ° С и се инокулира с инокулум от бутилка в съотношение 1: 9.

В процеса на аеробно култивиране, рН на средата се поддържа в границите от 6,8-7,2, захранвайки средата с 40% глюкоза до крайна концентрация 0,1-0,2%. Когато се достигне концентрацията от 20 милиарда бактериални клетки, добавянето на глюкоза се спира, докато рН спадне до 4,5 и подаването на въздух се изключи. След това нагряването на реактора се изключва, средата се охлажда до 20 o C. Получената охладена култура се изпомпва в контейнери или се опакова във флакони.

Лекарството "Subtilis" е безвредно, не съдържа чужда микрофлора. Безвредността е тествана върху бели мишки с тегло 18-20 g, които са приемали перорално лекарството в обем от 1,0 ml.

"Subtilis" има специфична активност: броят на клетките в една доза от лекарството (15-20) милиарда клетки/ml, антагонистична активност - зоната на забавяне на растежа на тестваните микроорганизми е от 6 до 34 mm.

Изобретението е илюстрирано с примери.

Пример 1. Бактериална хеморагична септицемия на шаран.

В езерцето се разболя двугодишен шаран с клинични признаци на бактериална хеморагична септицемия. Броят на болните риби достигна 43%. Лабораторният анализ на патогенния материал потвърди наличието на поливидова патогенна микрофлора във вътрешните органи на рибите. Предписано третиране с добавяне на 2,5 милиона микробни клетки (спори) "Subtilis" към фуража чрез овлажняване на 1 кг живо тегло на рибата. Храна със "Subtilis" се дава на риба веднъж дневно в продължение на 5 дни. 10 дни след края на курса на лечение беше установено, че броят на болните риби е намалял до 4%, а признаците на остро възпаление остават само в отделни екземпляри. Повърхността на тялото на рибата е станала равномерно лигава.

Пример 2. Аеромоноза (рубеола) на шаран.

В езерната икономика, с рязка промяна в условията на околната среда, тригодишният шаран се разболя от аеромоноза (рубеола) с наличието на ясни признаци на острия стадий на болестта и смъртта на рибите. Дневната смъртност на рибите е била 5% от общата. Бактериологично е установено разпространението на аеромонади, което представлява повече от 80% от общия брой патогени, изолирани от риби. Предписан курс на лечение с фураж, навлажнен със "Subtilis", в доза от 2,5 милиона спори на 1 kg живо тегло на рибата. Във връзка с намалената вкусовост, скоростта на хранене се определя веднъж дневно в продължение на 7 дни. Още на 5-ия ден от храненето смъртта на рибите намаля до 0,3-06% от общия брой, на 20-ия ден след края на курса започна общо възстановяване на стадото.

Пример 3. Некроза на пъстървови перки.

Във фермата за пъстърви при пъстърва се наблюдава остра форма на некроза на перките. Микробиологичното изследване на патогена разкрива наличието на патогени на Escherichia coli, Enterobacter, Citrobacter и Aeromonas (Aeromonas verenii, Aeromonas caviae). Съвместното култивиране на "Subtilis" с тази асоциация на микроорганизми показва неговата антагонистична активност и причинява пълна смърт на патогени на 4-ия ден. Дозировката на "Subtilis" беше 1-2 милиарда спорове.

Пример 4. Безопасност на пилетата през първите седмици.

В голяма птицеферма бяха проведени производствени тестове за ефективността на "Subtilis" за безопасността на пилетата през първите две седмици след засаждането им. Програмата за тестване предвижда изясняване на оптималните дози на "Subtilis", както и използването му в течна и лиофилизирана форма. Честотата на пилетата в контролната група е 2,38%. Средните отпадъци в експерименталните групи са: при даване на лиофилизиран "Subtilis" с храна - 1,33%, при пиене на течност "Subtilis" - 0,33%. В експерименталните групи пилетата наддават по-интензивно. Резултатите от претеглянето след първите три дни дадоха 61 g за контролната група, 70 g за експерименталната група.

Пример 5. Болести на новородени прасенца.

В голям комплекс за разплод на свине за дълго време имаше значителна (до 70-80%) смъртност на прасенца поради заболявания на стомашно-чревния тракт. Проведените микробиологични и патологични изследвания разкриха при прасенца няколко вида стомашно-чревни заболявания с бактериална етиология, сред които най-значими са признаците на гастроентерополит. Предписан курс на лечение: използването на "Subtilis" вътре веднага след раждането в размер на 1 доза за 5 прасета при 10% глюкоза в продължение на 4-5 дни. Курс на профилактика: употребата на "Subtilis" вътре в размер на 1 доза за 10 новородени прасенца при 10% глюкоза за 3 дни. Безопасността на прасенцата се е повишила до 92,5% и се поддържа стабилно чрез превенция на това ниво.

Проучванията показват ефективността на дадените количества от пробиотичния препарат, добавен към фуража.

ИСК

Бактериалният щам Bacillus subtilis VKM V-2250D, използван за получаване на пробиотичния препарат "Subtilis", предназначен за профилактика и лечение на стомашно-чревни заболявания на животни, птици и риби.