Серологични тестове с помощта на етикета. Имунофлуоресцентна реакция (директен и индиректен RIF), ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA), радиоимуноанализ (RIA), реакционен механизъм

В момента широко се използват серологични реакции, в които участват маркирани AGs или AT-la. Те включват реакции на имунофлуоресценция, радиоимуноанализ и ензимен имуноанализ.

1) за серодиагностика на инфекциозни заболявания, т.е.за откриване на антигени, използвайки набор от известни конюгирани (химически комбинирани) антигени с различни етикети (ензими, флуорохромни багрила);

2) за идентифициране на микроорганизъм или неговия серовар с помощта на стандартно маркирани диагностични антитела (експресна диагностика).

Серумите се приготвят чрез имунизиране на животни с подходящ AG-m, след това имуноглобулини се изолират и конюгират със светещи багрила (флуорохроми), ензими, радиоизотопи.

Обозначените СР по специфичност не отстъпват на другите СР и по своята чувствителност те надминават всички СР.

Няма свързани материали

Като етикет се използват светещи флуорохромни багрила (флуоросцеин изотиоцианат и др.).

Има различни модификации на RIF. За експресна диагностика на инфекциозни заболявания - за откриване на микроби или техните антигени в тестовия материал се използва RIF според Koons.

Съществуват два метода на RIF според Кунс: директен и индиректен.

Директни RIF компоненти:

1) тестовият материал (движение на червата, назофаринкса и др.);

2) маркиран специфичен имунен серум, съдържащ AT-la към желания антиген;

3) изотоничен разтвор на натриев хлорид.

Намазка от тестовия материал се третира с етикетиран антисерум.

Реакцията AG-AT се осъществява. По време на луминесцентно микроскопско изследване в областта, където са локализирани комплексите AG-AT, се открива флуоресценция - луминесценция.

Индиректни RIF компоненти:

1) изследвания материал;

2) специфичен антисерум;

3) антиглобулинов серум (AT-la срещу имуноглобулин), маркиран с флуорихром;

4) Изотоничен разтвор на натриев хлорид.

Намазка от тестовия материал първо се третира с имунен серум до желания антиген и след това с белязан антиглобулинов серум.

Светещи AG-AT комплекси - маркирани AT се откриват с помощта на флуоресцентен микроскоп.

Предимството на индиректния метод е, че няма нужда да се приготвя широк спектър от флуоресцентни специфични серуми и се използва само един флуоресцентен антиглобулинов серум.

Изолира се и 4-компонентна разновидност на индиректните RIF, когато се добавя допълнително комплемент (серум от морски свинчета). В случай на положителна реакция се образува сложен AG-AT - етикетиран - AT-комплемент.

RIF се основава на комбинацията от антигени на бактерии, рикетсии и вируси със специфични антитела, белязани с флуоресцентни багрила (флуоресцеин изотиоцианат, родамин, В-изоцианит, лисатиндарамин В-200, сулфохлорид и др.), Които имат реактивни групи (сулфиоцианолат и др.) .) ... Тези групи се комбинират със свободни аминогрупи на молекули на антитела, които не губят специфичен афинитет към съответния антиген, когато се третират с флуорохром. Образуваните комплекси AG-AT стават ясно видими, ярко светещи структури под луминесцентен микроскоп (фиг. 7). RIF може да открие малки количества бактериални и вирусни антигени. Методът RIF се използва в две версии: директен и индиректен метод.

Директният метод се основава на директната връзка на антиген с белязано антитяло. Косвен метод се основава на поетапното идентифициране на AG-AT комплекса с използване на флуоресцентни багрила. Първият етап се състои в образуването на имунни комплекси на специфичен антиген със специфични антитела. Вторият етап е да се идентифицира този комплекс, като се третира с белязан антигамаглобулин .

Предимството на RIF е простота, висока чувствителност, бързина за получаване на резултата. RIF се използва като метод за ранна бърза диагностика на грип, дизентерия, малария, чума, туларемия, сифилис и др. За това проучване се използва флуоресцентен микроскоп.

Радиоимуноанализ (RIA)

RIA е един от най-чувствителните методи на имунодиагностика. Използва се за откриване на антигена на вируса на хепатит В при пациенти с вирусен хепатит. За целта към тестовия серум се добавя референтен серум (серум, съдържащ антитела срещу вируса на хепатит В). Сместа се инкубира в продължение на 1-2 дни при 40 ° С, след това се добавя референтният антиген (антиген, белязан с 125 J изотоп) и инкубацията продължава още 24 часа. Към образувания комплекс антиген-антитяло се добавят утаяващи анти-имуноглобулини срещу референтни серумни протеини, което води до образуването на утайка (Фиг. 8). Резултатът се взема предвид от наличието и броя на импулсите в утайката, записани от брояча. Ако в изследвания серум има антиген, който се е свързал със специфични антитела, последните не се свързват с белязания антиген и следователно той не се открива в утайката. По този начин RIA се основава на принципа на конкурентно взаимодействие на антигена, който се определя, и известно количество белязан антиген с активните центрове на антителата.Радиоактивните изотопи се използват като етикет.

В зависимост от техниката на постановка има два начина за АРВ.

1) Техника "течна фаза" (класически RIA). Недостатъкът на тази техника на постановка е необходимостта

специално разделяне на свободни и свързани белязани антигени (или антитела).

2) Техника "твърда фаза".

AG или AT с известна специфичност се свързват със сорбенти (твърда фаза) - стените на полистиролов кладенец или пластмасова епруветка. Останалите компоненти на IC последователно се сорбират върху имобилизирания AG (AT).

В зависимост от естеството на реакцията се разграничават следните методи:

1) Състезателен метод - метод, основан на AG състезание.

а) определена AH (материал за изследване - кръв, храчки и др.);

б) белязан с радиоизотоп антиген, идентичен с изследвания AG-y;

в) специфична AT-la с известна концентрация, свързана със сорбента;

г) стандартна хипертония (контрол);

д) буферен разтвор.

2) Неконкурентен метод.

а) определен AG;

б) специфичен AT-a с известна концентрация, свързан-

ny на сорбента;

в) антитела, идентични на свързаното антитяло, маркирани

г) стандартен AG;

д) буферен разтвор.

Тестовият AG се добавя към обвързаните AT. В процеса на инкубация върху сорбента се образуват комплекси AG-AT. Сорбентът се измива от свободни компоненти и се добавят етикети AT, които се свързват със свободните валентности на AG-on в комплекса. Количеството радиоактивност е пропорционално на концентрацията на изследваната AG.

3) "Сандвич метод" (непряк метод) - най-често срещаният метод.

а) изследван серум (или изследван AG);

б) AG-и, свързани на сорбента (или AT-la, свързани на сорбента при определяне на AG-a);

в) диагностични антитела срещу имуноглобулини, маркирани с радиоизотопи;

г) контролни серуми (или AG);

д) буферни разтвори.

Изследваните антиглобулинови антитела (или антигени) реагират с твърдофазни антигени (антитела), след което инкубатът се отстранява и в реакцията се въвеждат белязани антиглобулинови антитела, които се свързват със специфични комплекси от антиглобулинови антитела на повърхността на сорбента. Количеството радиоактивност в реакцията е пряко пропорционално на количеството AT (или AG), което се изследва.

1) висока специфичност и чувствителност;

2) простота на техниката на постановка;

3) точността на количествената оценка на резултатите;

4) лесен за автоматизиране.

Недостатък: използване на радиоактивни изотопи.

Няма свързани материали (

Метод на имуноанализ (ELISA)

Методът се използва за откриване на антигени, като се използват съответните антитела, конюгирани с ензим-маркер (хрянова пероксидаза, b - галактоза или алкална фосфатаза). След комбиниране на антигена с ензимно белязан имунен серум, субстратът и хромогенът се добавят към сместа. Субстратът се разцепва от ензима и продуктите от неговото разграждане причиняват химическа модификация на хромогена. В този случай хромогенът променя цвета си - интензивността на цвета е право пропорционална на броя на свързани молекули на антиген и антитела (фиг. 9).

Най-често срещаният е ELISA в твърда фаза, при който един от компонентите на имунния отговор (антиген или антитяло) се сорбира върху твърд носител. Микропанелите от полистирол се използват като твърд носител. При определяне на антитела в ямките със сорбирания антиген се добавят последователно кръвен серум на пациенти, антиглобулинов серум, маркиран с ензим и смес от субстратни разтвори за ензима и хромогена. Всеки път след добавяне на следващия компонент, несвързаните реагенти се отстраняват от кладенците чрез цялостно измиване. Ако резултатът е положителен, цветът на разтвора на хромогена се променя. Носителят в твърда фаза може да бъде сенсибилизиран не само с антиген, но и с антитяло. След това желаният антиген се добавя към ямките с адсорбирани антитела, добавя се ензимно-белязан имунен серум срещу антигена и след това смес от разтвори на субстрата за ензима и хромогена.

ELISA се използва за диагностициране на заболявания, причинени от вирусни и бактериални патогени.Ензимите се използват като етикет: пероксидаза, алкална фосфатаза и др.

Индикатор за реакцията е способността на ензимите да предизвикват цветни реакции, когато са изложени на подходящ субстрат. Например, субстратът за пероксидаза е разтвор на ортофенилдиамин.

Най-широко използваният ELISA в твърда фаза. Същността на ELISA е подобна на RIA.

Резултатите от ELISA могат да бъдат оценени визуално и чрез измерване на оптичната плътност на спектрофотометър.

Предимствата на ELISA включват:

- липса на контакт с радиоактивни вещества;

- простота на методите за оценка на отговора;

- лесен за автоматизиране.

Въпреки това, в сравнение с RIA, се забелязва по-ниска чувствителност на метода, но в някои случаи чувствителността надвишава RIF и RIM.

Следните типове ELISA са дадени като примери:

Създаден за откриване на повърхностния антиген на вируса на хепатит В (HB3 Ad) в серуми и кръвна плазма при диагностициране на вирусен хепатит В и определяне на носенето на HB5 Ad.

1) серум или кръвна плазма на тестовия материал;

2) антитела срещу HBs Ad, адсорбирани на повърхността на кладенец на полистиролова микроплаки;

3) конюгат - миши моноклонални антитела към HBs Ad, белязани с пероксидаза,

4) ортофенилендиамин (OFD) -субстрат;

5) буфериран с фосфат физиологичен разтвор;

6) контролни серуми:

- положителен (серум с HBe Ad);

- отрицателен (серум без HBz Ad). Работен процес

1) Въвеждане на контролни и тестови серуми.

2) Инкубация за 1 час при 37 ° С.

3) Измиване на кладенци.

4) Въвеждане на конюгата.

5) Инкубация за 1 час при 37 ° С.

6) Измиване на кладенци.

7) Въвеждане на OFD. В присъствието на HBz Ad разтворът в ямките пожълтява.

Преброяването на ELISA се извършва чрез оптична плътност с помощта на фотометър. Степента на оптична плътност ще бъде обратно пропорционална на концентрацията на изследваната НВз А.

Реакцията протича в три фази:

1) HBs Ad на изследвания серум (плазма) се свързва с хомоложни антитела, адсорбирани на повърхността на ямката. Образува се IC AG-AT. (NVz Ad - sin \ NVz AT).

2) Антитела HBs Ad, белязани с пероксидаза, се свързват с останалите свободни детерминанти на HBs Ad на комплекса AG-AT. Образува се комплекс от AT-AG с етикет AT

3) OPD взаимодействат (с пероксидаза) на AT-AG-AT комплекса и се получава жълт цвят.

Е основната реакция на теста за диагностициране на ХИВ инфекция.

Предназначение: серологична диагностика на HIV инфекция - откриване на антитела срещу HIV антигени, Компоненти: