Сайт за репликация 0 (произход на репликация, произход на репликация, произход на репликация)

Този процес продължава непрекъснато по дължината на копираната структура и завършва в същия репликон с образуването на две молекули от типа "полуконсервиран".

А - бактериална клетъчна стена; В - мембраната на бактериалната клетка; С - флагела; D-цитоплазма; F - ензим; E е оригиналната ДНК; G - нова ДНК; О - мястото, където е започнала репликацията.

В големите линейни ДНК молекули на еукариотите има много точки на произход на репликацията и съответните репликони (от няколкостотин до десетки хиляди), т.е. такава ДНК е полирепликон.

Когато се разглеждат съвременните идеи за механизма на репликация на еукариотната ДНК, може условно да се разграничат три последователни етапа на този процес, протичащи в репликона, във всеки от които участват определени протеини (ензими).

Първа стъпка е свързано с бързото разплитане на две полинуклеотидни вериги на спирализирана ДНК молекула в определена част от нея (в границите на работещ репликон) и с тяхното разделяне чрез разкъсване на водородни връзки между двойки допълващи се бази. В този случай се образуват два едноверижни фрагмента от родителската молекула, всеки от които може да действа като матрица за синтеза на комплементарна (дъщерна) верига. Този етап се инициира при подходящия произход на репликацията и се медиира от сложното участие на няколко различни протеина. В резултат на тяхното действие се образува Т-образна структура, наречена репликационна вилица, при която двете родителски ДНК вериги вече са разделени една от друга (фиг.). Получената репликационна вилица се движи бързо по двойната спирала на родителската ДНК молекула поради активността на размотаващия ензим ДНК хеликаза и с участието на група дестабилизиращи протеини.

Фигура: Диаграма за образуване на вилица на репликация на ДНК

Тези протеини имат способността да се свързват само с едноверижни (вече разплетени и разделени) участъци на молекулата, предотвратявайки появата на вторични гънки (фиби) върху тях поради случайни връзки между комплементарни нуклеотиди от едноверижна структура . Следователно те допринасят за изправянето на едноверижни области на молекулата, което е необходимо за нормалното изпълнение на матрични функции от тях.

Бързото развиване на ДНК с помощта на хеликаза без допълнително завъртане на нишките една спрямо друга трябва да доведе до образуването на нови завои (възли) в областите на родителската молекула пред движещата се репликационна вилица, които създават повишено топологично напрежение в тях региони. Това напрежение се елиминира от друг протеин (ДНК топоизомераза), който, движейки се по двуверижната родителска ДНК пред репликационната вилица, причинява временни разкъсвания в една от веригите на молекулата, разрушавайки фосфодиестерните връзки и прикрепвайки към счупения край . Полученото разкъсване осигурява последващото завъртане на двойната спирала, което от своя страна води до разплитане на получените суперспирали (възли). Тъй като прекъсването на полинуклеотидната верига, причинено от топоизомераза, е обратимо, счупените краища се присъединяват бързо веднага след разрушаването на комплекса на този протеин със счупения край.

На втория етап се извършва матричен синтез на нови (дъщерни) полинуклеотидни вериги на базата на добре познатия принцип на допълващо съответствие на нуклеотидите на старата (матрица) и новите вериги. Този процес се извършва чрез комбиниране (полимеризиране) на нуклеотидите от новата верига, като се използват няколко вида ДНК полимеразни ензими. Трябва да се отбележи, че нито една от познатите днес ДНК полимерази не е в състояние да започне синтеза на нов полинуклеотид, като просто се комбинират два свободни нуклеотида. Инициирането на този процес изисква наличието на свободен 3'-край на която и да е полинуклеотидна ДНК (или РНК) верига, която е свързана с друга (комплементарна) ДНК верига. С други думи, ДНК полимеразата е способна да добавя нови нуклеотиди към свободния 3'-край на съществуващ полинуклеотид и следователно е в състояние да развива тази структура само в посока 5 '→ 3'.

Вземайки предвид това обстоятелство, асиметричният характер на функционирането на репликационната вилица става ясен (фиг.). Както се вижда от горните диаграми, на една от матричните нишки на вилицата 3 '→ 5') има относително бърз и непрекъснат синтез на дъщерната нишка (водеща или водеща верига) в посока 5 '→ 3 ', докато на другата матрица (5' → 3 ') има по-бавен и прекъснат синтез на изоставащата верига в къси фрагменти (100-200 нуклеотида), наречени фрагменти на Okazaki, а също и в посока 5' → 3 '.

Водещите и изоставащите вериги се синтезират от различни видове ДНК полимерази. Свободният 3'-край, който е необходим за започване на синтеза на фрагмента на Okazaki, се осигурява от къса РНК верига (около 10 нуклеотида), наречена РНК праймер (РНК праймер), която се синтезира с помощта на РНК примазен ензим. РНК праймерите могат допълнително да се сдвояват с няколко области на матричната ДНК верига наведнъж, създавайки условия за едновременния синтез на няколко фрагмента на Okazaki с участието на ДНК полимераза III (фиг. 1.10). Когато синтезираният фрагмент на Okazaki достигне 5'-края на следващия РНК праймер, 5'-екзонуклеазната активност на ДНК полимераза I започва да се проявява, което последователно разцепва РНК нуклеотидите в посока 5 '→ 3'. В този случай отстраненият РНК праймер се заменя със съответния ДНК фрагмент.

Последният (трети) етап на разглеждания процес е свързан с действието на ензима ДНК лигаза, който свързва 3'-края на един от фрагментите на Okazaki с 5'-края на съседния фрагмент, за да образува фосфодиестерна връзка, като по този начин възстановява първичната структура на изоставащата верига, синтезирана във функциониращ репликон. По-нататъшно спирализиране на възникващия "полуконсервиран" ДНК регион (спираловидно усукване) се случва с участието на ДНК-гираза и някои други протеини.

Фигура: Синтез на водещи и изоставащи ДНК вериги в областта на репликационната вилица

Принципът на полирепликона за организиране на ДНК молекулата на различни еукариоти, включително хора, дава възможност за последователно копиране на генетичния материал на тези организми, без едновременно размотаване (деспирализиране) на цялата огромна и сложно опакована молекула, което значително намалява времето за нейното размножаване. С други думи, по едно или друго време в една група репликони на молекулата, процесът на копиране вече може да бъде завършен чрез обединяването и спирализирането на съответните секции, докато в друга група той започва само чрез разплитане на двуверижни структури.

Фигура: Схематично представяне на процеса на репликация, числата показват: 1- изоставаща верига, 2- водеща верига, 3- ДНК полимераза (Polα), 4- ДНК лигаза, 5- РНК праймер, 6- ДНК примаза, 7- Оказаки фрагмент, 8- ДНК полимераза (Polδ), 9- хеликаза, 10- единична верига със свързани протеини, 11- топоизомераза

Ензими, участващи в репликация на еукариотна ДНК:

1. ДНК хеликаза и дестабилизиращи протеини; те разплитат двойната спирала на родителската ДНК и образуват репликационна вилица.

2. ДНК полимерази, които катализират синтеза на полинуклеотидната ДНК верига в посока 3'-5, копирайки шаблона в репликационната вилица с висока степен на точност. Тъй като двете вериги на двойната спирала на ДНК са антипаралелни, само една от двете вериги се синтезира непрекъснато в посока 5'-3 '- водещата; другата верига, изоставаща, се синтезира под формата на къси фрагменти от Оказаки. ДНК полимеразата е в състояние да коригира собствените си грешки, но не може сама да започне да синтезира нова верига.

3. ДНК примаза, която катализира къси молекули на РНК праймери. Впоследствие РНК фрагментите се отстраняват - те се заменят с ДНК.

4. Теломераза, завършваща изграждането на недостатъчно реплицирани 3'-краища на линейни ДНК молекули.

5. ДНК топоизомерази, помагащи за решаването на проблемите с усукване и заплитане на ДНК спиралата.

6. Инициаторни протеини, които се свързват в началото на репликацията и
допринасящи за образуването на ново репликационно око с една или две вилици. Във всяка от вилиците, следвайки инициаторните протеини, към размотаната ДНК първо се прикрепя протеинов комплекс, състоящ се от ДНК хеликаза и ДНК примаза (примозома). След това към примозомата се добавят други протеини и се появява „машина за репликация“, която извършва ДНК синтез.