Модифицирани полипептиди на растежен хормон

Изобретението се отнася до областта на биотехнологиите, по-специално до производството на модифициран растежен хормон, и може да се използва в медицината. Получава се рекомбинантен полипептид, който има антагонистична активност спрямо рецептора на растежния хормон. Изобретението осигурява полипептид, който е ефективен при лечение на състояния, причинени от излишък на растежен хормон в тялото на пациента. 6 n. и 5 к.с. cl, 19 dwg., 2 таб.

Изобретението се отнася до слети протеини на модифициран растежен хормон и димери, съдържащи споменатите слети протеини, молекули нуклеинова киселина, кодиращи споменатите протеини, и методи за лечение, включващи използването на споменатите протеини.

Растежният хормон (GH) е анаболен цитокинов хормон, важен за надлъжния растеж в детска възраст и нормалната конституция при възрастните. Регулирането на GH активността е сложно и включва няколко взаимодействащи полипептидни и пептидни агонисти и антагонисти. GH може да упражнява своите ефекти или директно чрез свързване на рецептора на растежния хормон, или индиректно чрез стимулиране на производството на инсулиноподобен растежен фактор-1 (IGF-1). По този начин основната функция на GH е да стимулира производството на IGF-1 от черния дроб. В допълнение, секрецията на GH се контролира от два пептидни хормона с противоположна активност. Фактор за освобождаване на хормона на растежа (GHRH) е пептид от 44 аминокиселини, образуван от дъгообразното ядро ​​на хипоталамуса. Той функционира, като стимулира производството на GH от предната хипофизна жлеза. Соматостатинът е пептиден хормон, който противодейства на ефектите на GHRH и е резултат от обработката на по-голям пре-пропептид, за да образува 14 и 28 аминокиселинни форми. Невроендокринните клетки на перивентрикуларното ядро ​​на хипоталамуса секретират соматостатин в хипоталамо-хипофизната портална вена, която свързва хипоталамуса с предната част на хипофизата, където соматостатинът инхибира секрецията на GH.

GH последователно се свързва с два рецептора за свързан с мембраната растежен хормон (GHRs) чрез две отделни места на GH, наречени сайт 1 и сайт 2. Сайт 1 е сайт за свързване с висок афинитет, а сайт 2 е сайт за свързване с нисък афинитет. Една GH молекула свързва 1 GHR през сайт 1. След това втори GHR се набира през сайт 2, за да образува GHR: GH: GHR комплекс. След това комплексът се интернализира и активира каскадата на трансдукция на сигнала, което води до промени в генната експресия. Извънклетъчният домен на GHR съществува като два свързани домена, всеки от които съдържа приблизително 100 аминокиселини (SD-100), със С-крайния домен на SD-100 (b), разположен най-близо до клетъчната повърхност, и N-крайния домен на SD-100 (a), разположен на най-далечното разстояние. Когато хормонът се свърже, има конформационна промяна в тези два домена с образуването на тримерен GHR-GH-GHR комплекс.

Излишъкът от GH е свързан с няколко болестни състояния, като акромегалия и хипофизарен гигантизъм. Повечето случаи на излишък на GH са резултат от тумор на хипофизата от соматотрофни клетки на предната хипофизна жлеза. Тези тумори са доброкачествени и постепенно увеличават секрецията на GH. Симптомите на излишния хормон на растежа включват удебеляване на костите на челюстта, пръстите на ръцете и краката, компресия на нерви/мускули и инсулинова резистентност. Основното лечение на свързания с тумора излишък на GH е хирургично отстраняване на тумора на хипофизата. Напоследък използването на GH антагонисти за инхибиране на GH сигнализирането се превърна в предпочитано лечение поради неинвазивния му характер. GH антагонистите могат да бъдат или рекомбинантни форми на соматостатин, аналози на соматостатин (например октреотид, ланреотид) или модифициран GH.

За преглед на модифицираните GH антагонисти вижте Kopchick (2003) European Journal of Endocrinology 148; S21-25, който описва търговски наличен антагонист на GH, наречен пегвизомант, който комбинира модификация на човешки GH в положение G120 с добавяне на полиетилен гликол за увеличаване на молекулното тегло на модифицирания GH. Проблемът, свързан с прилагането на растежен хормон, е бързото му изчистване чрез бъбречна филтрация и/или протеолиза. Добавянето на полиетилен гликол намалява тези загуби. Известно е обаче, че полиетилен гликолът намалява афинитета на GH към GHR и по този начин, за да се компенсира такъв намален афинитет, е необходимо да се въведат увеличени количества модифициран GH. Това може да доведе до странични ефекти. Ще бъде желателно да се осигури модифициран GH антагонист, който може да се прилага с по-ниска доза, като по този начин се избягват проблемите, свързани с пегвизоманта. Това може да бъде или намаляване на приложеното количество, или намаляване на честотата на приложение.

В един аспект, изобретението осигурява молекула нуклеинова киселина, съдържаща последователност на нуклеинова киселина, избрана от:

1) последователност на нуклеинова киселина, както е показано в SEQ ID NO: 1;

2) последователност на нуклеинова киселина, както е показано в SEQ ID NO: 2;

3) последователности на нуклеинови киселини, както е показано в SEQ ID NO: 4;

4) последователност на нуклеинова киселина, както е показано в SEQ ID NO: 5;

5) последователност на нуклеинова киселина, както е показано в SEQ ID NO: 7;

6) последователности на нуклеинови киселини, както е показано в SEQ ID NO: 8;

7) последователност на нуклеинова киселина, както е показано в SEQ ID NO: 10;

8) последователности на нуклеинови киселини, както е показано в SEQ ID NO: 11;

9) последователност на нуклеинова киселина, както е показано в SEQ ID NO: 13;

10) последователност на нуклеинова киселина, както е показано в SEQ ID NO: 14;

11) последователности на нуклеинови киселини, както е показано в SEQ ID NO: 16;

12) последователности на нуклеинови киселини, както е показано в SEQ ID NO: 17;

13) последователности на нуклеинови киселини, както е показано в SEQ ID NO: 19;

14) последователност на нуклеинова киселина, както е показано в SEQ ID NO: 20;

15) последователност на нуклеинова киселина, както е показано в SEQ ID NO: 22;

16) последователност на нуклеинова киселина, както е показано в SEQ ID NO: 23;

17) молекула нуклеинова киселина, съдържаща последователност на нуклеинова киселина, хибридизираща при строги условия на хибридизация със SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22 или 23;

и кодиране на полипептид, притежаващ антагонистична активност на рецептора на растежен хормон.

Хибридизация на молекула нуклеинова киселина се получава, когато между две комплементарни молекули нуклеинова киселина се образуват много водородни връзки. Строгостта на хибридизацията може да варира в зависимост от условията на околната среда около нуклеиновите киселини, естеството на процеса на хибридизация и състава и дължината на използваните молекули нуклеинова киселина. Изчисленията относно условията на хибридизация, необходими за постигане на определена степен на строгост, са обсъдени в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001); и Tijssen, Лабораторни техники в биохимията и молекулярната биология - хибридизация със сонди за нуклеинова киселина, част I, глава 2 (Elsevier, Ню Йорк, 1993). Tm е температурата, при която 50% от дадена верига на молекула нуклеинова киселина се хибридизира до нейната комплементарна верига. По-долу е даден примерен диапазон от условия на хибридизация и не е ограничаващ.

Много строги условия (позволяват хибридизация на последователности, имащи поне 90% идентичност)