Какво представлява методът PCR 6 и какво включва?

Много заболявания изискват създаването на нови, по-чувствителни методи за тяхното определяне. Много от съществуващите вече помагат за поставяне на диагноза, но не винаги го правят надеждно. Вложен PCR вече може точно да диагностицира повечето инфекциозни заболявания. Какво е това изследване?

Преглед на верижната реакция на полимеразата

За първи път PCR се използва в молекулярната биология. Същността на тази реакция е следната - увеличаване на количеството ДНК фрагменти в тествания разтвор чрез реакцията на амплификация. В допълнение, тази реакция позволява изкуствени мутации на определени фрагменти от наследствен материал, клониране на гени, изследване на генетична информация.

Методът се състои в копиране на определени фрагменти от ДНК при специално създадени условия. Копира се само определен фрагмент, тъй като неговата селективност се определя от изследователя чрез създаване на определени условия на околната среда и добавяне на определени реакционни компоненти (ензими, промотори и терминатори).

Реакцията позволява амплифициране на малки участъци от ДНК (за разлика от реакцията на репликация, която се случва в живите организми). Резултатът е среда с дъщерни ДНК фрагменти, образувани върху оригиналната матрица, получена от биологичен материал.

Кръвен тест: какво е включено в изследването?

Задължителният състав на компонентите на тази реакция е както следва:

Матрица или област за копиране. Обикновено геномът на вирусна или бактериална клетка действа като матрица (тъй като PCR обикновено се извършва за диагностициране на инфекциозни заболявания).
Грунд - участък от нуклеотидната верига със свободна хидроксилна група, с помощта на която удължаването на ДНК веригата започва от 3-комплементарния край на изследваната ДНК.
ДНК полимераза. Основният ензим на полимеразната верижна реакция. С негова помощ има натрупване на нуклеотиди в новообразуваната ДНК верига.
Дезоксирибонуклеозидни трифосфати.
Магнезий. В присъствието на тези йони в разтвор е възможна активността на ДНК полимераза.
Буферна среда, в която протичат всички реакции.
Висококипящи масла. Използва се за предотвратяване на изпаряване на реакционната среда.
Пирофосфатаза. Използва се за увеличаване образуването на клонинги на анализираната ДНК (чрез инхибиране образуването на пирофосфат, което от своя страна инхибира образуването на клонинги).

По принцип PCR се извършва с помощта на две двойки праймери - "вложени".

Скрининг за полово предавани инфекции

В момента PCR се използва широко при изследване на полово предавани инфекции (ППИ). Най-честата вариация на PCR е PCR-6 - реакция, насочена към откриване на хламидия, уреаплазма, микоплазма и трихомонада в тестовия материал. Реакцията е насочена към изолиране на техните ДНК компоненти (тъй като секретираният от гениталния тракт не съдържа техните антигени или метаболитни продукти, тъй като тези паразити са вътреклетъчни). Други методи не се използват, тъй като с тяхна помощ е възможно да се определят продуктите на жизнената дейност или самият микроорганизъм при изхвърлянето от гениталния тракт. Микроскопията на намазка с определен цвят или електронна микроскопия все още има определена информативна стойност. Въпреки това, те все още предпочитат да използват PCR за диагностициране на ППИ.

Както всяка друга полимеразна реакция, PCR-6 за откриване на ППИ протича на 3 етапа:

На първия етап изследваната смес се загрява до около 90 градуса (при тази температура ДНК веригата се денатурира с разкъсване на междуверижните връзки). Нагряването се извършва за 2-3 минути. С образуването на едноверижни фрагменти първият етап завършва и започва следващият.
На следващия етап реакционната смес се охлажда постепенно, за да могат праймерите да се свържат с ДНК веригите. Етапът се нарича отгряване. Ако температурата е неправилно избрана (златният стандарт е температура около 5 градуса под температурата на топене на праймерите), резултатите от реакцията могат да бъдат изкривени и да се получат неправилни ДНК области, както е планирано (ако температурата е под необходимата ), или неспецифични реакционни компоненти (ако температурата е твърде висока). Етапът продължава около 30 секунди, през което време ДНК полимеразата вече образува няколкостотин базови двойки на ДНК клонинга.
На третия етап, етапа на удължаване, синтезираната ДНК верига се удължава. Извършва се на два етапа: на първия етап, който продължава 10 минути, основната верига на клонинга се удължава, а на втория етап, етапа на окончателното удължаване, несдвоените едноверижни компоненти, които е възможно да присъстват в разтвора са завършени.

Както можете да видите, времето за всеки от етапите е надеждно известно, но се изчислява за идеални условия. Обикновено обаче реакцията може да протече за по-малко или повече от определено време - това зависи от концентрацията на веществата, наличието на матрица.

Уникалността на проучването

Характеристика на вложената PCR е, че на първия етап се образува специална част от молекулата на ДНК - cDNA, която служи като шаблон за следващия етап. Въпреки това, поради възможни кръстосани разговори, има чести случаи на фалшиво положителни или фалшиво отрицателни резултати.

В резултат на всички проведени етапи изследователят получава разтвор, съдържащ ДНК фрагменти, изградени върху оригиналната матрица. Техният брой се дължи на времето на всички етапи, количеството на реагентите, условията на околната среда.

Обикновено в разтвора доминират специфични продукти - ДНК фрагменти поради въвеждането на праймери. Други вещества и молекули, образувани по време на реакцията, не са специфични, тъй като не са необходими праймери за тяхното образуване. Въпреки това, понякога те могат да бъдат решаващи при поставяне на определена диагноза.

Диагностиката на ППИ, причинени от вътреклетъчни паразити, се извършва въз основа на присъствието на клиниката, оплакванията на пациента. За изследването се взема намазка от лигавицата на гениталните органи (при изхвърлянето не винаги е възможно да се открие, например, хламидия). Изключение прави ситуацията, когато е надеждно известно, че лигавичните клетки присъстват в отделянето от гениталиите.

По-късно получените намазки се въвеждат в средата, след което започва PCR реакцията. Курсът му не се различава от стандартния: същите стъпки, същите необходими вещества.

При определяне на инфекции, предавани по полов път, използването на кръв за изследвания обикновено е неподходящо, тъй като в много редки случаи патогенът прониква във вътрешната среда на тялото (в този случай развитието на други нетипични заболявания (например микоплазма или хламидиална пневмония, уреоплазмен менингит).

Диагностични резултати

Диагнозата на заболяването се извършва въз основа на определяне на специфичната ДНК характеристика на определен микроорганизъм (в този случай генетичния материал на тези вътреклетъчни патогени). Ако резултатът е отрицателен, не трябва веднага да поставяте отрицателна диагноза, тъй като реакцията може да се обърка, в резултат на което започнаха да се образуват грешни фрагменти от ДНК вериги. Фалшиво положителни резултати са възможни, когато е настъпила кръстосана реакция (т.е. ДНК веригата на нормална клетка може да мутира, за да симулира присъствието на микроорганизъм). Обикновено обаче, ако са изпълнени всички условия, реакцията протича правилно и нейната чувствителност и специфичност са почти 100%.

Несъмнените предимства на тази реакция са точността на получените данни, висока чувствителност и специфичност, както и скоростта на получаване на резултати (обикновено изследването отнема не повече от един ден).

Недостатъците на реакцията са сложността на спазването на всички горепосочени условия, точността на създаване на температурен и киселинен режим. В допълнение, тази реакция изисква сложно оборудване, което не всяка лаборатория може да закупи. За идентифициране на получените резултати се изисква висококвалифициран човек, който е наясно с хода на реакцията, възможните й продукти и е в състояние правилно да интерпретира получената информация, за да постави правилната диагноза.

Обикновено PCR за ППИ се предписва в случая, когато диагнозата не може да бъде поставена по общия клиничен метод. Тези методи включват общ анализ на кръв и урина, биохимия на кръвта, както и бактериологично изследване (култура) при наличие на секрет от гениталния тракт.

Като цяло PCR е много добър метод за диагностициране на повечето заболявания. Неговата висока точност и специфичност позволяват да се идентифицира почти всяко инфекциозно заболяване със 100% сигурност. С течение на времето тази техника със сигурност ще бъде включена в минималния списък с тестове за диагностика на повечето заболявания, свързани с инфекциозен процес и генетични мутации.