Основни ензими, използвани в генното инженерство

Рестриктази и ДНК метилази

Сред ензимите, използвани в генното инженерство за клониране, рестрикционните ендонуклеази са от голямо значение - рестрикционни ензими. Тези ензими, открити за първи път като част от системата за модифициране на ДНК рестрикцията в бактериите, по-специално хидролизират двуверижни ДНК молекули, когато съдържат определени нуклеотидни последователности, наречени сайтове за ограничение. В същото време метилазите се използват за ограничаване на броя на рестрикционните места и получаване на по-големи фрагменти на ДНК с помощта на рестрикционни ензими.

Класификация на ограничителни ензими. Според механизма на действие и молекулната структура се разграничават три вида рестрикционни ендонуклеази. Рестрикционните ензими тип I са сложни мултимерни комплекси, изградени от три субединици с молекулно тегло до 300 kDa, които имат рестрикционни ензими, ДНК метилаза и АТФазна активност. Рестрикционните ендонуклеази от тип I изискват наличието на ATP, S-аденозилметионин и Mg 2+ йони, за да проявят своята активност; те не разпознават специфични нуклеотидни последователности и следователно не се използват широко в генното инженерство. Рестриктазите от тип II разпознават специфични нуклеотидни последователности в точката на разцепване на ДНК или в непосредствена близост до нея, изискват присъствието на ATP и Mg 2+ йони в реакционната смес, за да се прояви активността и най-често се използват при молекулярно клониране . Ензимите от тип III също са активни само в присъствието на ATP и Mg 2+ йони и не показват абсолютна зависимост от S-аденозилметионин.

Фигура: II.1. Форми на двуверижни разкъсвания на ДНК, образувани от рестрикционни ендонуклеази

и - 5'-изпъкнали (1), 3'-изпъкнали "лепкави" (2) и "тъпи" (3) краища на ДНК, образувани от рестрикционни ензими BamHАз, Kpnаз и PvuII съответно. Стрелките показват местата на разкъсвания на веригите на ДНК, пунктираната линия - оста на симетрия на рестрикционните места;

б - лигиране със загуба на място за ограничение

Рестриктазните имена се състоят от първите букви на видовите имена на бактерии, в които те се намират, например Еко - Е. coli. В случая, когато рестрикционни ензими с различна специфичност присъстват в клетки от различни щамове от един и същ бактериален вид, в името на рестрикционния ензим се въвежда допълнителна буква, например рестрикционен ензим Хинк и Хинд изолирани от бактериални клетки на Haemophilus influenzae, щамове c и d. Цифрите след буквените обозначения отразяват последователността на отваряне на съответните рестрикционни ендонуклеази в клетките на бактерии от същия вид, например ХеАз, ХеII и ХеIII от H. aegipticus.

Рестриктазите от тип II са основното средство за генно инженерство. Повечето рестрикционни ензими тип II разпознават специфично тетра- и хексануклеотидни последователности на ДНК и поне три от тях са октануклеотиди. Колкото по-къса е олигонуклеотидната последователност на рестрикционното място, разпозната от рестрикционния ензим, толкова по-често се среща в произволна нуклеотидна последователност, в която всеки от четирите нуклеотида е представен с еднаква честота (50% A - T двойки и 50% G - C двойки). По този начин произволна тетрануклеотидна последователност се появява средно на всеки 256 bp. (4 4) и хексануклеотид - на всеки 4096 bp. (4 6). Въпреки това, в естествената ДНК разпределението на нуклеотидите може да се различава значително от случайното. Например, еукариотните ДНК се характеризират с ниска честота на поява на CpG динуклеотид и съответно места на рестрикция, съдържащи тези динуклеотиди (рестрикционни ензими ХхаАз, HpaII, TaqАз, ThaАз, АваАз, ХеII, ХиндII, SalI, СмаАз, XhoАз, XmaI). Значително отклонение на честотата на поява на рестрикционни места от очакваното за тяхното произволно разпределение по ДНК е характерно и за хромозомите на термофилни бактерии, които, напротив, се характеризират (макар и не във всички случаи) с обогатяване в G - С двойки. Повечето места, разпознати от рестрикционни ендонуклеази от тип II, се характеризират с наличието на симетрия от втори ред, т.е. разпознаваните от тях последователности са палиндроми, например в рестрикционния ензим EcoRАз съм 5'-GAATTC-3 '. Това означава, че нуклеотидите, разположени във всяка от нишките на еднакво разстояние от оста на симетрия, са взаимно допълващи се. Ако точките на разцепване на противоположните ДНК вериги са изместени една спрямо друга в рестрикционното място, тогава получените рестрикционни краища на ДНК съдържат изпъкнали едноверижни области. Тъй като такива сайтове допълват себе си и помежду си и могат да си взаимодействат помежду си, те често се наричат "лепкави краища. В "лепкавите" краища изпъкналият едноверижен регион може да бъде 5'- или 3'-край (Фиг. II.1,и). Официалната индикация на 5 'или 3' надвиснали лепкави краища на рестрикционните места е местоположението на точката на разцепване на ДНК веригите в последователността, използвана за обозначаване на рестрикционното място съответно отляво или отдясно на оста на симетрия. В някои рестрикционни ендонуклеази точките на разцепване и на двете ДНК вериги са разположени точно една под друга на мястото на рестрикцията. В този случай след разцепване на ДНК не се образуват „лепкави“ краища, а се получават така наречените „тъпи“ краища, в които няма изпъкнали едноверижни ДНК области (вж. Фиг. II.1,и). Има една основна функционална разлика между 5'- и 3'-изпъкналите "лепкави" краища - последните не могат да бъдат маркирани чрез удължаване с ДНК полимераза. Тази характеристика трябва да се има предвид при избора на рестрикционни ензими за получаване на рестрикционни ДНК фрагменти, които трябва да се използват като сонди.

При проектирането на рекомбинантни молекули е полезно да се помни, че макар и рестрикционни ензими BamHАз, BclАз, BglII и XhoРазпознавам различни сайтове за ограничение, те образуват едни и същи лепкави краища, GATC. Същото важи и за рестрикционната ензимна група SalGАз, Xhoаз и АваI (NCGA). При лигиране (виж по-долу) ДНК фрагменти, образувани от рестрикционни ендонуклеази на една от тези групи, те се комбинират, но оригиналните рестрикционни места се губят в резултат на образуването на нова непрекъсната нуклеотидна последователност (виж фиг. II.1,б). Местата на рестрикция за някои рестрикционни ензими тип II не са симетрични. Например, рестрикционен ензим HgaРазпознавам асиметричната последователност 5'-GACGC-3 'и въвежда едноверижни разкъсвания в противоположни ДНК вериги, премествайки съответно 5 и 10 нуклеотида вдясно:

Нуклеотидните последователности на получените лепкави краища са уникални за всяко такова рестрикционно място. В резултат на това рестрикционните ДНК фрагменти, образувани под действието на този рестрикционен ензим в сместа, са свързани помежду си само в строго определена начална последователност, която се определя от уникални нуклеотидни последователности в "лепкавите" краища на рестрикционните ДНК фрагменти . Например, когато този рестрикционен ензим разцепва репликативната форма на ДНК на фаг fX174, се образуват 14 фрагмента, които in vitro се комбинират в правилната последователност, за да образуват инфекциозна fX174 ДНК.

Универсални рестрикционни ензими за едноверижна ДНК. Въз основа на рестрикционни ензими, разпознаващи асиметрични нуклеотидни последователности, е разработена система, която позволява разцепването на едноверижни ДНК молекули във всяка дадена точка. За тази цел се синтезира олигонуклеотид, 5'-крайната част на който съдържа място, разпознато от такъв рестрикционен ензим, а нуклеотидната последователност на 3'-крайната част е комплементарна на ДНК региона, където ендонуклеазният пробив трябва да да бъдат въведени. В резултат на хибридизация на олигонуклеотида с едноверижна ДНК, структурата, показана на фиг. II.2. В този случай ензимът взаимодейства с мястото за разпознаване (сайт I) и на местата, посочени със стрелките, се въвеждат прекъсвания. По този начин положението на мястото на разцепване на ендонуклеазата ще зависи изцяло от нуклеотидната последователност на област II на синтетичния олигонуклеотид, комплементарен на ДНК субстрата.

Фигура: II.2. Едноверижно разцепване на ДНК с универсален рестрикционен ензим

и - синтетичен олигонуклеотид; б - едноверижна ДНК.

След образуване на фиби и хибридизация с едноверижна ДНК мишена, олигонуклеотидът образува място за свързване на рестрикционен ензим (сайт I) и ДНК-ДНК хибридно място за разцепване (сайт II). Стрелките показват местата на ендонуклеазно разцепване на ДНК и олигонуклеотид

Изошизомери. Клетките от различни бактериални видове могат да съдържат рестрикционни ензими, които разпознават едни и същи рестрикционни места. Такива рестрикционни ензими се наричат изошизомери. Изошизомерите на някои рестрикционни ендонуклеази се използват успешно за откриване на метилирани ДНК области в генома. И така, рестрикционни ензими Ххааз и HpaII разцепват неметилираните GCGC и CCGG последователности, съответно, и губят способността да се разцепват, ако поне един от цитозиновите остатъци в тези места е метилиран. В същото време ензимът MspI (изошизомер HpaIi) разцепва CCGG последователността, независимо дали цитозиновите остатъци на такова място са метилирани или неметилирани. N-метилирането на аденозиновите остатъци в ДНК може да бъде открито с помощта на изошизомери Со3A (разцепва както метилирани, така и неметилирани GATC последователности), DpnI (разцепва само метилирани G Me ATC последователности) и МбоI (разцепва само неметилирани последователности).

Промени в специфичността на действието на рестрикционните ендонуклеази при неоптимални условия. Рестриктазите са силно специфични ензими. За да се поддържа тази специфичност in vitro, е необходимо да се поддържат оптимални условия за ензимно действие в реакционната смес. Когато тези условия са нарушени, някои рестрикционни ензими започват да проявяват вторична (т.нар. Тире) активност. И така, рестрикционен ензим EcoRI разцепва GAATTC последователността при pH 7,3, 100 mM NaCl в присъствието на 5 mM MgCl2, но с промяна в стойностите на pH, намаляване на концентрацията на NaCl или заместване на Mg 2+ йони с Mn 2+, както и присъствието на органични разтворители, ензимът има тенденция към разцепване на по-късата AATT последователност (т.нар. активност EcoRI). Рестрикционните ензими със сходни свойства също включват BamHАз, BstАз, BsuАз, DdeАз, ХхаАз, PstАз, СалАз, SstАз, XbaАз.

Рестрикционно ензимно действие върху необичайни субстрати. В допълнение към двуверижната ДНК, много рестрикционни ензими са в състояние да използват ДНК-РНК хибриди като субстрат. Това се отнася по-специално за рестрикционните ензими EcoRАз, ХиндII, СалАз, MspАз, ХхаАз, АлуАз, Taqаз и ХеIII. Някои рестрикционни ензими, например ХеIII, Ххааз и SfaI, са способни да разцепват едноверижна фагова fX174 ДНК, макар и със значително по-ниска скорост от съответната двуверижна RF форма. Тази способност е доказана за няколко други рестрикционни ензими, както и за ДНК субстрати. Остава неясно дали тези рестрикционни ензими разпознават истински едноверижни сайтове или нуклеотидни последователности, затворени във вторични структурни елементи.

С развитието на метода на полимеразна верижна реакция (PCR) (виж по-долу) често е необходимо да се усвояват амплифицирани олигонуклеотиди с рестрикционни ензими близо до техните краища, т.е. при условия, когато рестрикционното място е фланкирано от единия му край от един или повече нуклеотиди. В този случай се установява ясна зависимост на способността на някои рестрикционни ендонуклеази да разцепват рестрикционните места от броя на нуклеотидите, фланкиращи мястото. Това свойство на рестрикционните ензими се обяснява по-специално с факта, че в самите краища на двуверижната ДНК молекула се получава локално топене на ДНК двойната спирала с образуването на къси едноверижни области, които улавят мястото на разпознаване рестрикционни ензими. Локалното топене може да бъде частично избегнато чрез понижаване на температурата на реакционната смес по време на ограничаването на такива олигонуклеотиди. Тъй като тези данни са от голямо значение за практическото генно инженерство, те са обобщени в табл. II.1.